作者kg9101266 (Chin)
看板Biotech
标题[求救] 新手想请问关於SDS-PAGE的问题
时间Sun Nov 8 11:37:13 2009
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
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我是做10%gel 0.75尺寸的胶
sample 和 2X sample buffer 是1:1 然後会用1X sample buffer去补到同体积(补到24ul)
(2Xsample buffer: sample buffer 95ul + BME 5ul
1X : 2Xsample buffer 50ul + MQwater 50ul)
Q1
看BIO-RAD说明书上写
10WELL的一个WELL可以low33ul体积
我一个sample需要low进well的量只有24ul
可是不管我怎麽小心、缓慢的low
还是会满出来
可以很明显看到淡蓝色沿着well的"凹"字底部溢出道"凹"字两个高点
我是拿20ul的pipement转到12分两次low
通常要low第二次时，就感觉已经快满出来了
观察sample的沉降，觉得还好，也是会沉下去
但就不会像mark一样完全沉在well底部变成一条线
我老板说我可能low太快，把sample冲上去，或是sample buffer配不准
但sample buffer配法就如同第一段所写
low的速度也确实很缓慢了
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Q2
想请问大家是怎麽配胶的?
我自己的配法是照我老板所说
配方都加到15ml管後，VOTEX约10秒
倒进去玻璃内
可是有同事跟我说votex会让胶的结构被破坏
跑出来的band会扭曲，不会是一直线
ex放大图: 扭--^---^^- 直---------
我自己在跑，明明做法都一样，但有时候跑出来是直的，有时候却会是扭的
然後，跑的时候扭，压出来也是扭的>"<
我们家跑上胶是固定电流0.03A，下胶是固定电流0.06A
但是常常会到达最高电压250V
我同事说我们家跑的电压太大@@"
所以才跑不漂亮
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我以前从未跑过western
最近跑过几次，都有一些疑问，很希望可以把胶跑得漂亮
想请各位前辈帮忙指点一下 十分感激
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 114.40.219.15
1F：推 leoblack:load sample前你会冲洗well嘛? 11/08 12:08
2F：推 tsubasawolfy:vortex会破坏结构XDDD 网状结构是倒下去才慢慢形成 11/08 12:24
3F：→ tsubasawolfy:的吧? 15cc的配到10cc以上难vortex 可以改用50cc 11/08 12:24
4F：→ tsubasawolfy:震个1.2下均匀就好 10秒会有很多泡泡吧? 11/08 12:25
5F：推 loham:dye 加多一点,让sample重一些好沉,电压确实太大,要不然就放 11/08 12:34
6F：→ loham:冰上跑,电压这麽大会很烫,电压大也会扭 11/08 12:35
7F：→ Anvec:用尺量一下齿槽大小换算一下体积 就可以猜可以 load 多少啦 11/08 12:56
8F：→ Anvec:不过要估少一点 0.75mm 胶片 我手残 我都只会 load 20ul 11/08 12:57
9F：→ Anvec:电压太高会过热 胶的孔洞会不均匀 就会歪歪扭扭 11/08 12:59
10F：→ Anvec:除非有 cooler 或是丢cold room 11/08 13:00
11F：→ Anvec:配 SDS-PAGE 用 stir 就好 用 Vortex 会产生气泡 很麻烦 11/08 13:01
12F：→ Anvec:体积少的时候用 pipette 也可以:P 11/08 13:02
13F：推 DFS:我用离心管(回收)配胶 盖上後不摇只用手旋转後就可铸胶了 11/08 14:03
14F：→ DFS:另外loading量.75我都只load 2~4uL 从未load到满过... 11/08 14:04
15F：→ DFS:sample的蛋白量就要算得很精准 这样跑出来的结果很漂亮 11/08 14:05
16F：→ DFS:跑胶时我都定电压 上胶60~70V下胶95~110V只有Transfer时才设A 11/08 14:08
17F：→ DFS:不过.75的gel因为loading量太少 我都改1.0 or 1.5 11/08 14:09
18F：→ DFS:这样sample量就可以拉高不少,但最多也只load到30uL 11/08 14:10
19F：→ kg9101266:下胶凝固後要做上胶之前和上胶拔掉齿梳後 我都会用 11/09 00:40
20F：→ kg9101266:running buffer 冲洗3次 11/09 00:40
21F：→ kg9101266:用vortex的确很容易起泡，我会偷偷用drop把泡泡吸走再倒 11/09 00:46
22F：→ kg9101266:因为我们的sample浓度不高 所以low的体积就...而且很珍 11/09 00:50
23F：→ kg9101266:贵 所以暂时无法再取得。想请问一下，如果不加1X dye补 11/09 00:51
24F：→ kg9101266:成同体积 跑出来会很丑吗? 11/09 00:53
25F：→ kg9101266:loham大大，请问dye的增加是指?2x dye和sample比例不是 11/09 00:55
26F：→ kg9101266:一定要1:1吗? 抱歉，我对於这方面真的很不熟...>"< 11/09 00:55
27F：→ kg9101266:谢谢楼上各位前辈这麽热心回答 受益良多 >"< 11/09 00:56
28F：→ kg9101266:DFS大 我们刚好跟您家相反呢...跑胶时固定电流 TRANSFER 11/09 00:59
29F：→ kg9101266:时则是固定电压(15V) 一次只transfer一片GEL 11/09 01:01
30F：推 toocool5941:sample buffer + sample 可 = 1:2 = 5ul + 10ul 11/09 01:20
31F：→ toocool5941:蛋白浓度若太低可浓缩 11/09 01:21
32F：→ toocool5941:配胶千万别vortex，气泡的确会破坏结构和影响凝胶 11/09 01:22
33F：→ toocool5941:固定电压或电流都，但固定电压比较保险。电流较多变因 11/09 01:25
34F：推 loham:我的意思是dye在sample比例增加,楼上你是不是打错啊? 这样 11/09 01:53
35F：→ loham:sample buffer(dye)更稀耶? 11/09 01:54
36F：→ loham:怕体积太大就用4X dye阿~ 11/09 01:55
37F：推 loham:我们家学长是管耗材的,他都是4X dye当2X用,load起来超沉的 11/09 02:01
38F：→ loham:据说增加sample的盐类也会比较重,可是这我没试过,我同学是把 11/09 02:03
39F：→ loham:补体积的DDW用PBS取代,听说会比较沉,这个我也没试过 11/09 02:05
40F：推 loham:电流电压其实只要懂原理,国中理化公式代一代,怎麽跑怎麽OK的 11/09 02:09
41F：推 toocool5941:我意指每well容积只要15ul就很足够了。 11/09 02:10
42F：→ loham:不管是定电压或定电流,注意温度,温度影响蛋白外也影响电阻 11/09 02:11
43F：→ toocool5941:若用PBS，盐类会增加电阻，lane的边边容易拖尾 11/09 02:12
44F：→ loham:影响电阻,电流电压就会变,runing的状态怎样就可以体会了 11/09 02:13
45F：→ loham:所以增加盐类不是好方法阿~~ 受教授教! 还好没试XD 11/09 02:14
46F：推 toocool5941:跑胶时固定电压或电流影响较小，但transfer时- 11/09 02:17
47F：→ toocool5941:固定电流需注意每张纸大小必须裁的刚刚好，否则电流- 11/09 02:18
48F：→ toocool5941:往电阻比较小的低方去，则影响效率 11/09 02:18
49F：推 loham:那要看机器,我用过超多牌子的,现在实验室用的Hofer最容易冒 11/09 02:19
50F：→ loham:烟,电压高的时候不放冰包都超烫,胶会变形orz 用来用去台制 11/09 02:21
51F：→ loham:东生便宜又好用 11/09 02:22
52F：→ alulu:load快一点看看 有时候太慢 扩散开来 反而停在很高的地方 11/09 09:40
53F：→ DFS:我也用hofer跑胶and Transfer 整个system就放4度C冰箱内跑 11/09 10:30
54F：→ Anvec:因为 Hofer 的胶比较大片 电阻相对就高呀 :D 不要加盖就好了 11/09 11:09
55F：→ Anvec:但是bio-rad 的系统好像一定要加盖 太久没用 忘了 11/09 11:10
56F：→ Anvec:不加盖可以降一点点温度 11/09 11:11
57F：推 cyin592:东生好用+1 塞冰块下去 400 mA 1h 水都还是冷的 11/10 10:38
58F：→ cyin592:有种专门load样品的tip 前端很细 load大体积 较不会溢出来 11/10 10:41
59F：→ cyin592:上面400 mA 指的是transfer时 XD 11/10 10:42
60F：→ kg9101266:谢谢大家的意见 感觉好有收获 再次感谢喔^_^ 11/10 21:50