作者B4sunrise (Inno Milan!!)
看板Biotech
標題[求救] 請問一下貼盤細胞收蛋白
時間Sun Nov 1 11:42:55 2009
請教一下各位學長姊!
我所養的細胞是黑色素細胞Melanocyte，他是一種貼盤細胞！
之前做Western收蛋白時，都是利用trypsin打下後，離心去除trypsin及medium後，用PBS
wash後，再依pellet大小判定加入RIPA的體積，濃度都可以收的蠻高的。
可是後來因為要看細胞中Rho,Rac,cdc42的磷酸化表現,以觀察藥物細胞filopodia的形成
情形！
我查paper的結果，filopodia生成到結束大約在兩分鐘內！
所以我設計了一組實驗，打算分別以藥物作用0,2,4,6,8分鐘，然後收取蛋白做western
由於細胞自體平衡機制的關係，我擔心以trypsin打下細胞，光trypsin作用的時間，
細胞就會自體平衡，使得最後磷酸化情形不明顯！
所以我是將medium吸掉，用冰的PBSwash後，加入RIPA於冰上作用10分鐘後，直接將細胞
刮下收蛋白,問題是蛋白的濃度都相當的低,皆不到1mg/ml...
請各位學長姊救救我..已經試了一個多月..還沒辦法改進!!謝謝!
註:細胞是種於10cm的dish，大約8分滿時，收蛋白
RIPA成分:Tris-HCL 50mM
EDTA 1mM
NaCl 150mM
NP-40 1%
Triton 1%
還有protease inhibitor
以及Phospo stop
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 210.64.98.254
1F：→ ordinary07:你兩種方式加的RIPA量相等嗎!? 11/01 11:48
2F：→ B4sunrise:用trypsin收加RIPA的量比較少些..大概0.1ml 11/01 11:59
3F：→ ordinary07:那就對拉 你加等量的ripa 結果就差不多摟 11/01 12:06
4F：→ ordinary07:你可以試試直接用1ml PBS加下去刮下來 用小烏龜離一下 11/01 12:08
5F：→ ordinary07:去上清液 在加RIPA 不然就直接加比較少的RIPA刮 11/01 12:08
6F：→ ordinary07:其實我不太懂為啥要多用trypsin這道手續... 11/01 12:10
7F：→ datro:而且 trypsin不是會增加蛋白濃度 ＝ ＝？ 11/01 13:11
8F：→ datro:應該是說 會誤判 11/01 13:12
9F：推 oplz:好多 ！！！！！！！！！ 11/01 16:35
10F：推 liuse:直覺做IF會不會更好 一來filopodia可觀察 二來不用怕 11/01 20:41
11F：→ liuse:你說的生成到結束的短時間 11/01 20:41
12F：→ B4sunrise:先謝謝各位的回答!RIPA的量我已經盡量減少了，十公分的 11/02 00:29
13F：→ B4sunrise:dish用0.2ml已經快到極限了..不過先用PBS刮下這招我倒是 11/02 00:31
14F：→ B4sunrise:沒想過!謝謝!用trypsin的作用是將細胞打下,不過離心後會 11/02 00:33
15F：→ B4sunrise:吸除,所以不會影響濃度!IF的化學姊之前已經有做了！不過 11/02 00:34
16F：→ B4sunrise:老師認為IF出來的結果過為主觀，filopodia生成多寡無法 11/02 00:35
17F：→ B4sunrise:數據化,所以希望我用western來證明有影響，謝謝各位!! 11/02 00:36
18F：推 reinherd:你看的paper作者也適用這種作法嗎？ 如果是你何不寫個ema 11/02 00:51
19F：→ reinherd:il問問看原作者呢？ 我之前就有這樣子試過 11/02 00:51
20F：→ reinherd:並且一般來說 會先trypsin下來在用RIPA的目的是為了拿 11/02 00:52
21F：→ reinherd:一部分的cell pellet去抽RNA 另一部分抽protein 如果只是 11/02 00:53
22F：→ reinherd:抽protein可以直接加RIPA在cell上面 11/02 00:53
23F：推 xenosdk:十公分的dish 100 uL的lysis buffer沒問題吧.. 我都是這 11/02 05:10
24F：→ xenosdk:收的 11/02 05:10
25F：→ B4sunrise:好的！謝謝您!我會試試看!!^ ^ 11/02 11:39
27F：→ sneak: //daxiv.com 01/03 17:02