作者B4sunrise (Inno Milan!!)
看板Biotech
标题[求救] 请问一下贴盘细胞收蛋白
时间Sun Nov 1 11:42:55 2009
请教一下各位学长姊!
我所养的细胞是黑色素细胞Melanocyte，他是一种贴盘细胞！
之前做Western收蛋白时，都是利用trypsin打下後，离心去除trypsin及medium後，用PBS
wash後，再依pellet大小判定加入RIPA的体积，浓度都可以收的蛮高的。
可是後来因为要看细胞中Rho,Rac,cdc42的磷酸化表现,以观察药物细胞filopodia的形成
情形！
我查paper的结果，filopodia生成到结束大约在两分钟内！
所以我设计了一组实验，打算分别以药物作用0,2,4,6,8分钟，然後收取蛋白做western
由於细胞自体平衡机制的关系，我担心以trypsin打下细胞，光trypsin作用的时间，
细胞就会自体平衡，使得最後磷酸化情形不明显！
所以我是将medium吸掉，用冰的PBSwash後，加入RIPA於冰上作用10分钟後，直接将细胞
刮下收蛋白,问题是蛋白的浓度都相当的低,皆不到1mg/ml...
请各位学长姊救救我..已经试了一个多月..还没办法改进!!谢谢!
注:细胞是种於10cm的dish，大约8分满时，收蛋白
RIPA成分:Tris-HCL 50mM
EDTA 1mM
NaCl 150mM
NP-40 1%
Triton 1%
还有protease inhibitor
以及Phospo stop
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 210.64.98.254
1F：→ ordinary07:你两种方式加的RIPA量相等吗!? 11/01 11:48
2F：→ B4sunrise:用trypsin收加RIPA的量比较少些..大概0.1ml 11/01 11:59
3F：→ ordinary07:那就对拉 你加等量的ripa 结果就差不多搂 11/01 12:06
4F：→ ordinary07:你可以试试直接用1ml PBS加下去刮下来 用小乌龟离一下 11/01 12:08
5F：→ ordinary07:去上清液 在加RIPA 不然就直接加比较少的RIPA刮 11/01 12:08
6F：→ ordinary07:其实我不太懂为啥要多用trypsin这道手续... 11/01 12:10
7F：→ datro:而且 trypsin不是会增加蛋白浓度 ＝ ＝？ 11/01 13:11
8F：→ datro:应该是说 会误判 11/01 13:12
9F：推 oplz:好多 ！！！！！！！！！ 11/01 16:35
10F：推 liuse:直觉做IF会不会更好 一来filopodia可观察 二来不用怕 11/01 20:41
11F：→ liuse:你说的生成到结束的短时间 11/01 20:41
12F：→ B4sunrise:先谢谢各位的回答!RIPA的量我已经尽量减少了，十公分的 11/02 00:29
13F：→ B4sunrise:dish用0.2ml已经快到极限了..不过先用PBS刮下这招我倒是 11/02 00:31
14F：→ B4sunrise:没想过!谢谢!用trypsin的作用是将细胞打下,不过离心後会 11/02 00:33
15F：→ B4sunrise:吸除,所以不会影响浓度!IF的化学姊之前已经有做了！不过 11/02 00:34
16F：→ B4sunrise:老师认为IF出来的结果过为主观，filopodia生成多寡无法 11/02 00:35
17F：→ B4sunrise:数据化,所以希望我用western来证明有影响，谢谢各位!! 11/02 00:36
18F：推 reinherd:你看的paper作者也适用这种作法吗？ 如果是你何不写个ema 11/02 00:51
19F：→ reinherd:il问问看原作者呢？ 我之前就有这样子试过 11/02 00:51
20F：→ reinherd:并且一般来说 会先trypsin下来在用RIPA的目的是为了拿 11/02 00:52
21F：→ reinherd:一部分的cell pellet去抽RNA 另一部分抽protein 如果只是 11/02 00:53
22F：→ reinherd:抽protein可以直接加RIPA在cell上面 11/02 00:53
23F：推 xenosdk:十公分的dish 100 uL的lysis buffer没问题吧.. 我都是这 11/02 05:10
24F：→ xenosdk:收的 11/02 05:10
25F：→ B4sunrise:好的！谢谢您!我会试试看!!^ ^ 11/02 11:39
27F：→ sneak: //daxiv.com 01/03 17:02