作者inveigh (invection )
看板Biotech
標題[求救] 抽RNA會降解
時間Sat Oct 31 13:10:42 2009
我是抽取關節液離心下來的細胞RNA.裡面應該是白血球之類的細胞.不過很像沒有像一般
細胞這麼純.總之大約一個eppendorf中有大約120mg的細胞.
他們現在都是放在-80度.並沒有加trizol. 但我要抽取RNA好像都會degrade.
我是將sample從-80度c冰箱拿出後就直接放冰上.然後加入從4度C冰箱拿出的TRIZOL.
直接加入大約1.2ml TRIZOL.就用20G空針將cell回溶於TRIZOL中.過程中會在冰上進行.
會有一些白白的粘稠物體可以被homogenized.但還是會有一些怎樣都溶不了的部分.
PROTOCOL是說這些insoluble可以12000g 離心去除.不過又有人說這些insoluble如果沒有
homogenized的話就會造成RNA degrade?
不過無論有沒有完全homogenized. 我就放室溫5min.不知道這邊是不是那些insoluble造成
RNA degrade?
RNA抽出來跑TAE電泳並非是全部smear很嚴重.不過就是十來條bands.看起來像marker那樣.
不過我想這就是degrade了吧??
所以就沒有再去轉cDNA了.....
想問問各位有經驗的人.我應該要如何handle 從-80度冰箱拿出來的frozen sample呢?
我知道sample有一點點thawed就會RNA degrade.但是不懂的是.加入TRIZOL不可能就自己
homogenized啊.還是需要花上兩三分鐘的時間讓sample慢慢溶化在TRIZOL.然後才能
homogenize. 拜託大家幫幫我啊.....這些sample取得不易啊......感謝
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◆ From: 61.230.123.18
1F：→ soom:感覺問題是出在之前凍存的步驟沒有做處理 10/31 14:28
2F：推 ookubo:怎麼不抽出來就加TRIZOL呢？ 至少有RNase抑制的效果~ 11/01 10:49
3F：→ ookubo:不然就抽出來就直接做到酒精沉澱再丟-80度C，要用再溶.. 11/01 10:51
4F：→ ookubo:你既然要轉cDNA，sample又很珍貴，ABI有kit是符合需求的.. 11/01 10:52
5F：→ reinherd:建議冷凍前就要加trizol或是其他廠牌的lysis buffer 11/02 00:54
6F：→ reinherd:直接冷凍一定會degrade 你們的學長姊的protocol難道都是 11/02 00:55
7F：→ reinherd:直接冷凍？？ 11/02 00:55
8F：→ inveigh:那是之前的人留下來的sample.所以沒有辦法挽救了>.< 11/02 18:47
9F：→ reinherd:那可能要用特殊的kit來抽不能用trizol 很貴 11/04 04:08