作者inveigh (invection )
看板Biotech
标题[求救] 抽RNA会降解
时间Sat Oct 31 13:10:42 2009
我是抽取关节液离心下来的细胞RNA.里面应该是白血球之类的细胞.不过很像没有像一般
细胞这麽纯.总之大约一个eppendorf中有大约120mg的细胞.
他们现在都是放在-80度.并没有加trizol. 但我要抽取RNA好像都会degrade.
我是将sample从-80度c冰箱拿出後就直接放冰上.然後加入从4度C冰箱拿出的TRIZOL.
直接加入大约1.2ml TRIZOL.就用20G空针将cell回溶於TRIZOL中.过程中会在冰上进行.
会有一些白白的粘稠物体可以被homogenized.但还是会有一些怎样都溶不了的部分.
PROTOCOL是说这些insoluble可以12000g 离心去除.不过又有人说这些insoluble如果没有
homogenized的话就会造成RNA degrade?
不过无论有没有完全homogenized. 我就放室温5min.不知道这边是不是那些insoluble造成
RNA degrade?
RNA抽出来跑TAE电泳并非是全部smear很严重.不过就是十来条bands.看起来像marker那样.
不过我想这就是degrade了吧??
所以就没有再去转cDNA了.....
想问问各位有经验的人.我应该要如何handle 从-80度冰箱拿出来的frozen sample呢?
我知道sample有一点点thawed就会RNA degrade.但是不懂的是.加入TRIZOL不可能就自己
homogenized啊.还是需要花上两三分钟的时间让sample慢慢溶化在TRIZOL.然後才能
homogenize. 拜托大家帮帮我啊.....这些sample取得不易啊......感谢
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◆ From: 61.230.123.18
1F：→ soom:感觉问题是出在之前冻存的步骤没有做处理 10/31 14:28
2F：推 ookubo:怎麽不抽出来就加TRIZOL呢？ 至少有RNase抑制的效果~ 11/01 10:49
3F：→ ookubo:不然就抽出来就直接做到酒精沉淀再丢-80度C，要用再溶.. 11/01 10:51
4F：→ ookubo:你既然要转cDNA，sample又很珍贵，ABI有kit是符合需求的.. 11/01 10:52
5F：→ reinherd:建议冷冻前就要加trizol或是其他厂牌的lysis buffer 11/02 00:54
6F：→ reinherd:直接冷冻一定会degrade 你们的学长姊的protocol难道都是 11/02 00:55
7F：→ reinherd:直接冷冻？？ 11/02 00:55
8F：→ inveigh:那是之前的人留下来的sample.所以没有办法挽救了>.< 11/02 18:47
9F：→ reinherd:那可能要用特殊的kit来抽不能用trizol 很贵 11/04 04:08