作者kuroo (東京宿便★娯楽)
看板Biotech
標題[求救] Ligation一直失敗
時間Wed Oct 21 23:05:33 2009
目前vector是4kb的pACYCDuet-1，
insert是2kb的PCR product，尾端有多設計2個nucleotide給RE作用
反應時一端為blunt end，另一端是sticky end
ligation前，確定電泳上的大小正確
ligation條件是：
Vector:insert約1:5
16℃ over night
Fermentase ligate 5ul
目前重做兩次
挑出來的clone都是Vector only
感覺insert沒有接上去
因為同時做的另一組方法完全一樣
只是Vector不一樣(insert類似)，已經成功做出來了
pACYCDuet-1在電泳膠上看大小是2kb
但用RE切一刀後會回到4kb
可能表示pACYCDuet-1易有supercoil
不知道會不會影響ligation？
目前想到的辦法可能是在ligation時加入PEG
或者換成其他cloning site
但總覺得跟問題無關
麻煩大家幫我看看... >.<~~
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 122.120.34.115
1F：推 conective:只留兩個nt給RE作用夠用嗎？ 10/21 23:11
2F：推 smilehong:會站不穩喔 10/21 23:24
3F：推 liuse:RE是用哪個？ 10/21 23:25
4F：推 wensing:有外加ATP? 10/21 23:37
5F：推 reinherd:blunt end本來就難ligation, 加上只有2bps來ligate 10/22 04:23
6F：→ kuroo:以往只多加2個base都有做出來, 所以就一直沿用2個 @@" 10/22 09:39
7F：→ kuroo:ligation buffer裡有ATP, 另外sticky end是用AatII切 10/22 09:40
8F：→ conective:多留幾個比較保險 4-6個 10/22 09:43
9F：→ conective:另外一組成功的也是用AatII切嗎？ 10/22 09:44
10F：→ kuroo:成功的那組sticky end是AvrII, 但vector不同, 是用pETDuet 10/22 09:52
11F：推 hchs890843:PCR product先接到pTA上, 再切下來去接成功率比較高 10/22 12:27
12F：→ hchs890843:此外我還用小米的ligation buffer, 好像我成功率就大增 10/22 12:28
13F：→ hchs890843:參考一下吧:D 10/22 12:28
14F：推 howeichu:感覺是vector的問題 如果切的好的話 應該不會self-ligate 10/22 18:52
15F：推 micocat:vector切完有CIAP嗎 10/23 01:55
16F：→ kuroo:有 >.< 10/23 10:56
17F：推 mimique:小米的LIGAITON BUFFER是哪家? 10/23 12:19
18F：推 micocat:那insert有加PNK嗎 有一端是blunt end 10/23 14:06
19F：推 hchs890843:小米就是...google找小米柑仔店 10/23 23:32