作者kuroo (东京宿便★娯楽)
看板Biotech
标题[求救] Ligation一直失败
时间Wed Oct 21 23:05:33 2009
目前vector是4kb的pACYCDuet-1，
insert是2kb的PCR product，尾端有多设计2个nucleotide给RE作用
反应时一端为blunt end，另一端是sticky end
ligation前，确定电泳上的大小正确
ligation条件是：
Vector:insert约1:5
16℃ over night
Fermentase ligate 5ul
目前重做两次
挑出来的clone都是Vector only
感觉insert没有接上去
因为同时做的另一组方法完全一样
只是Vector不一样(insert类似)，已经成功做出来了
pACYCDuet-1在电泳胶上看大小是2kb
但用RE切一刀後会回到4kb
可能表示pACYCDuet-1易有supercoil
不知道会不会影响ligation？
目前想到的办法可能是在ligation时加入PEG
或者换成其他cloning site
但总觉得跟问题无关
麻烦大家帮我看看... >.<~~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 122.120.34.115
1F：推 conective:只留两个nt给RE作用够用吗？ 10/21 23:11
2F：推 smilehong:会站不稳喔 10/21 23:24
3F：推 liuse:RE是用哪个？ 10/21 23:25
4F：推 wensing:有外加ATP? 10/21 23:37
5F：推 reinherd:blunt end本来就难ligation, 加上只有2bps来ligate 10/22 04:23
6F：→ kuroo:以往只多加2个base都有做出来, 所以就一直沿用2个 @@" 10/22 09:39
7F：→ kuroo:ligation buffer里有ATP, 另外sticky end是用AatII切 10/22 09:40
8F：→ conective:多留几个比较保险 4-6个 10/22 09:43
9F：→ conective:另外一组成功的也是用AatII切吗？ 10/22 09:44
10F：→ kuroo:成功的那组sticky end是AvrII, 但vector不同, 是用pETDuet 10/22 09:52
11F：推 hchs890843:PCR product先接到pTA上, 再切下来去接成功率比较高 10/22 12:27
12F：→ hchs890843:此外我还用小米的ligation buffer, 好像我成功率就大增 10/22 12:28
13F：→ hchs890843:参考一下吧:D 10/22 12:28
14F：推 howeichu:感觉是vector的问题 如果切的好的话 应该不会self-ligate 10/22 18:52
15F：推 micocat:vector切完有CIAP吗 10/23 01:55
16F：→ kuroo:有 >.< 10/23 10:56
17F：推 mimique:小米的LIGAITON BUFFER是哪家? 10/23 12:19
18F：推 micocat:那insert有加PNK吗 有一端是blunt end 10/23 14:06
19F：推 hchs890843:小米就是...google找小米柑仔店 10/23 23:32