作者icome (木村阿宅)
看板Biotech
標題[求救] cDNA量很低
時間Fri Oct 16 15:34:06 2009
小弟是抽RNA新手
我用TRizol抽RNA 翻cDNA 再做PCR 訊號都很微弱
即使是GAPDH也要30cycles才看得到產物
拿別人抽的cDNA一起跑 25cycles就很清楚
所以應該是RNA或是RT出問題
實驗室其他人用這套系統很正常 問題應該是出在我身上
下面是我的操作過程 請板上各位大大幫我看看哪裡有問題 感謝!
1. 細胞養到五分滿在6cm dish，倒掉medium後放冰上，加入1ml Trizol。
2. 移到1.5ml離心管，加入200ul chloroform，先上下搖晃再vortex。
(博後說不能vortex?可是有些protocol寫vortex 15sec)
3. 靜置冰上到分層出現，離心13000rpm 10min
(轉速太高會影響嗎嗎?)
4. 吸出上清液約400ul到新離心管，加入400ul isopropanol上下搖晃，
離心13000rpm 10min
5. 此時有看到白色pellet，到掉上清加入1ml 75%酒精離心13000rpm 10min
6. 倒掉酒精後，倒蓋離心管，約10分鐘後無明顯水漬，加20ul DEPC-treated水，
反覆pipetting讓RNA溶解。
(需要用冰水嗎，我的水都放室溫，難道用室溫的水RNA就自爆了?)
7. 分管測濃度，或跑膠。
我用DNA的系統(TAE and DNA dye)去跑RNA，有部份degrade，但還看得到major bands
ratio都有1.8~1.9 濃度1.2~1.8ug/ul
8.加入oligodT和dNTP於65度C作用5min，再放到冰上，加入RTase、DTT和buffer。
(我用4X反應，體積80ul，total RNA 20ug)
7. 50度C反應1hr
(我用水浴槽，溫度不是很準 大概50~52度)
8. 70度C 15min終止反應。
感謝各位耐心看完!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.121.97
1F：→ ordinary07:那個 為啥跑RT要用水浴槽阿... 用跑PCR的機器跑就好拉 10/16 17:56
2F：推 ericial:第四步擺一下 大約十分鐘再離心比較好 10/16 20:40
3F：推 kirby0415:第4步可以-20或-80 overnight 10/16 20:49
4F：→ f9361046:第2步 可以vortex 15s 10/17 00:10
5F：推 f9361046:第四步 擺一下 回收率會比較高 10/17 00:12
6F：推 su9602:第8步,你確定你的mRNA有很明顯的poly(A)嗎? 10/18 14:06
7F：→ icome:因為實驗室只有oligodT 感謝上述意見 我改進一下試試 10/19 09:38
8F：→ saviora:你加完DEPC-water後 55度煮個10分鐘 10/19 19:26
9F：推 zeroking0519:第6步加水溶解前把酒精烘乾，有差 10/20 10:22
10F：→ zeroking0519:vortex沒差，我都vortex 10/20 10:22
11F：推 raxjimmy:跑電泳400bp那邊有碎片表示過程有RNase污染 10/25 22:09
12F：推 raxjimmy:通常抽的好的話跑電泳會看到很漂亮的兩條rRNA band 10/25 22:10
13F：→ icome:THX 我抽成功了! 感謝各位 10/26 10:43