作者icome (木村阿宅)
看板Biotech
标题[求救] cDNA量很低
时间Fri Oct 16 15:34:06 2009
小弟是抽RNA新手
我用TRizol抽RNA 翻cDNA 再做PCR 讯号都很微弱
即使是GAPDH也要30cycles才看得到产物
拿别人抽的cDNA一起跑 25cycles就很清楚
所以应该是RNA或是RT出问题
实验室其他人用这套系统很正常 问题应该是出在我身上
下面是我的操作过程 请板上各位大大帮我看看哪里有问题 感谢!
1. 细胞养到五分满在6cm dish，倒掉medium後放冰上，加入1ml Trizol。
2. 移到1.5ml离心管，加入200ul chloroform，先上下摇晃再vortex。
(博後说不能vortex?可是有些protocol写vortex 15sec)
3. 静置冰上到分层出现，离心13000rpm 10min
(转速太高会影响吗吗?)
4. 吸出上清液约400ul到新离心管，加入400ul isopropanol上下摇晃，
离心13000rpm 10min
5. 此时有看到白色pellet，到掉上清加入1ml 75%酒精离心13000rpm 10min
6. 倒掉酒精後，倒盖离心管，约10分钟後无明显水渍，加20ul DEPC-treated水，
反覆pipetting让RNA溶解。
(需要用冰水吗，我的水都放室温，难道用室温的水RNA就自爆了?)
7. 分管测浓度，或跑胶。
我用DNA的系统(TAE and DNA dye)去跑RNA，有部份degrade，但还看得到major bands
ratio都有1.8~1.9 浓度1.2~1.8ug/ul
8.加入oligodT和dNTP於65度C作用5min，再放到冰上，加入RTase、DTT和buffer。
(我用4X反应，体积80ul，total RNA 20ug)
7. 50度C反应1hr
(我用水浴槽，温度不是很准 大概50~52度)
8. 70度C 15min终止反应。
感谢各位耐心看完!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.121.97
1F：→ ordinary07:那个 为啥跑RT要用水浴槽阿... 用跑PCR的机器跑就好拉 10/16 17:56
2F：推 ericial:第四步摆一下 大约十分钟再离心比较好 10/16 20:40
3F：推 kirby0415:第4步可以-20或-80 overnight 10/16 20:49
4F：→ f9361046:第2步 可以vortex 15s 10/17 00:10
5F：推 f9361046:第四步 摆一下 回收率会比较高 10/17 00:12
6F：推 su9602:第8步,你确定你的mRNA有很明显的poly(A)吗? 10/18 14:06
7F：→ icome:因为实验室只有oligodT 感谢上述意见 我改进一下试试 10/19 09:38
8F：→ saviora:你加完DEPC-water後 55度煮个10分钟 10/19 19:26
9F：推 zeroking0519:第6步加水溶解前把酒精烘乾，有差 10/20 10:22
10F：→ zeroking0519:vortex没差，我都vortex 10/20 10:22
11F：推 raxjimmy:跑电泳400bp那边有碎片表示过程有RNase污染 10/25 22:09
12F：推 raxjimmy:通常抽的好的话跑电泳会看到很漂亮的两条rRNA band 10/25 22:10
13F：→ icome:THX 我抽成功了! 感谢各位 10/26 10:43