作者FUSION87 (一起企都都轟阿)
看板Biotech
標題[方法] protein denaturation
時間Wed Oct 14 12:39:06 2009
大家好
小弟目前在純化蛋白的時候遇到了一些瓶頸
小弟的目標是從e-coli中純化出重組蛋白
並且之後希望可以進行EMSA等能測activity的實驗
我的target protein絕大部分為solube form，inclusion body內的量很少
而我發現我的target protein會跟另外一個protein有hydrophobic interaction
我用的是TALON的Cobalt resin 抓His-tag
鹽濃度落在300~500mM 同時裡面也有加0.4%的NP-40及10%Gcerol
同時也wash很多次了 還是會有contamination
每當純化下來的時候 都會一起純化下來
而且量還不少..滿多的orz
現在我想到的方法是利用Urea先去denature這些蛋白
只是是否單純要denature蛋白也需要用到8M的高濃度??
因為表現量不高 所以在renature透析的時候會lost掉不少
不知道能不能用低點的濃度去denature以減少透析的次數??
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.98.145
1F：推 aggaci:還沒到不得已時，別做refolding.... 10/14 14:14
2F：→ aggaci:做二次純化... 10/14 14:16
3F：→ FUSION87:我兩個蛋白相差10kDa gel filtration 怕分不開.. 10/14 15:25
4F：推 wensing:如何確定是hydropobic interaction？ 10/14 17:42
5F：→ wensing:有試過單純的host會不會有這雜蛋白？ 10/14 17:43
我在Host內表現三四種蛋白 其中2個是substrate (暫且稱為A) & SUMO-His
另外兩個是SUMOylation的E1、E2
已經確定會在host內進行sumoylation 而產生isopeptide bond
我想要純化這個A-SUMO-His
因為發現說不管怎麼做都會把我要的target跟A都純化下來
猜測應該是A上有motif跟SUMO作用 (突變掉之後，會改善很多，但是無法完全克服)
而查了paper是hydrophobic interaction
6F：推 damyr:調pH沉澱，高NaCl濃度低temp可降低hydrophobic interaction 10/14 18:53
7F：→ damyr:換Host，有很多方法可以改進的 10/14 18:54
不好意思 不太懂高鹽大概是指多高呢?另外我全程都是在4度操作
※ 編輯: FUSION87 來自: 140.114.98.145 (10/14 19:21)
8F：推 asolitary:NaCl濃度高低溫我倒覺得還好~不過調pH倒是有機會 10/16 23:17
9F：→ asolitary:但用his純化不宜用酸性條件純化~所以pH使用上會被限制住 10/16 23:20
10F：→ asolitary:所以可以考慮用陰陽離子純化後再串聯his-taq 10/16 23:21
11F：→ asolitary:另外硫胺也可以考慮做看看~加油吧!! 10/16 23:22