作者FUSION87 (一起企都都轰阿)
看板Biotech
标题[方法] protein denaturation
时间Wed Oct 14 12:39:06 2009
大家好
小弟目前在纯化蛋白的时候遇到了一些瓶颈
小弟的目标是从e-coli中纯化出重组蛋白
并且之後希望可以进行EMSA等能测activity的实验
我的target protein绝大部分为solube form，inclusion body内的量很少
而我发现我的target protein会跟另外一个protein有hydrophobic interaction
我用的是TALON的Cobalt resin 抓His-tag
盐浓度落在300~500mM 同时里面也有加0.4%的NP-40及10%Gcerol
同时也wash很多次了 还是会有contamination
每当纯化下来的时候 都会一起纯化下来
而且量还不少..满多的orz
现在我想到的方法是利用Urea先去denature这些蛋白
只是是否单纯要denature蛋白也需要用到8M的高浓度??
因为表现量不高 所以在renature透析的时候会lost掉不少
不知道能不能用低点的浓度去denature以减少透析的次数??
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.98.145
1F：推 aggaci:还没到不得已时，别做refolding.... 10/14 14:14
2F：→ aggaci:做二次纯化... 10/14 14:16
3F：→ FUSION87:我两个蛋白相差10kDa gel filtration 怕分不开.. 10/14 15:25
4F：推 wensing:如何确定是hydropobic interaction？ 10/14 17:42
5F：→ wensing:有试过单纯的host会不会有这杂蛋白？ 10/14 17:43
我在Host内表现三四种蛋白 其中2个是substrate (暂且称为A) & SUMO-His
另外两个是SUMOylation的E1、E2
已经确定会在host内进行sumoylation 而产生isopeptide bond
我想要纯化这个A-SUMO-His
因为发现说不管怎麽做都会把我要的target跟A都纯化下来
猜测应该是A上有motif跟SUMO作用 (突变掉之後，会改善很多，但是无法完全克服)
而查了paper是hydrophobic interaction
6F：推 damyr:调pH沉淀，高NaCl浓度低temp可降低hydrophobic interaction 10/14 18:53
7F：→ damyr:换Host，有很多方法可以改进的 10/14 18:54
不好意思 不太懂高盐大概是指多高呢?另外我全程都是在4度操作
※ 编辑: FUSION87 来自: 140.114.98.145 (10/14 19:21)
8F：推 asolitary:NaCl浓度高低温我倒觉得还好~不过调pH倒是有机会 10/16 23:17
9F：→ asolitary:但用his纯化不宜用酸性条件纯化~所以pH使用上会被限制住 10/16 23:20
10F：→ asolitary:所以可以考虑用阴阳离子纯化後再串联his-taq 10/16 23:21
11F：→ asolitary:另外硫胺也可以考虑做看看~加油吧!! 10/16 23:22