※ 引述《pent (情人去死)》之銘言： : 抱歉，問個笨問題 : bradford assay測濃度，BSA建standard curve : duplicate,96-well plate : sample 10ul+ 190 bradford reagent : reagent 5倍稀釋 : (mg/ml) : sample OD1 OD2 average : 1 1.0329 1.0275 1.0302 : 0.5 0.7091 0.714 0.71155 : 0.25 0.3947 0.439 0.41685 : 0.125 0.209 0.2159 0.21245 : 0.0625 0.0833 0.0659 0.0746 ^^^^^^^^^^ 你都是2倍稀釋，中間應該穿插個其他質數倍數的稀釋，像是3倍或5倍 : Blank 0.0034 -0.0034 ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ Blank是什麼？空的還是有加buffer？ 目前我做過的實驗吸光值是沒有負值的，所以我也採用 基本上我會建議Blank要放等體積的Buffer去和Bradford混合 而非單純只加Bradford，甚至是什麼都不加 以你的實驗而言就是10uL sample buffer + 190uL Bradford 我幫你利用你的數值重新算過一次 看圖的感覺是濃度1已經飽和了 這也是Bradford常有的問題，濃度1對他而言濃度太高，會低估 所以我將濃度1的這個點去除不拿來作為曲線的參考值 結果為：y = 1.4199x + 0.0211 R平方=0.9849 : 100倍稀釋 : sample average conc. : IP 0.0134 0.0118 0.0126 -7.136746 : before 0.0326 0.035 0.0338 -5.095398 : A 0.101 0.1 0.1005 1.327145 : B 0.0675 0.0707 0.0691 -1.696361 : 趨勢線的公式：y=0.9629x-0.0835 r square>0.95 ^^^^^^^^^^^^^ 第一點，也是很重要的一個基礎點，r平方值要大於0.99 其實你的技術還不差但還需要再以加熟練 但因為你的1/4跟1/16的二重覆相差頗大 我以人工選擇的方式利用以下數據作曲線 Standard OD1 OD2 AV 1/2 0.71155 1/4 0.3947 1/8 0.21245 1/16 0.0833 得到結果為：y = 1.4035x + 0.0216 R平方=0.9931 雖然得到漂亮的數值，但是參考的點數太少，基本上還是建議你重做 這個人工篩選是很不得已的情況才做，畢竟是一個很主觀的作法 不符合實驗需要"客觀"的研究跟探討的態度 第二點，以你的結果數據來看，100倍稀釋太多了 (為什麼會說"你的數據"是因為你的算法) 濃度一旦出現負值，一定是你稀釋過度 這是一個觀念，得到負值時要注意 但是，如果以我幫你重新作出來的數據來算的話結果如下 Sample Av.OD Conc. A 0.1005 5.621660135 B 0.0691 3.384396152 就都是正值啦!! 看起來雖然有數據好像可以使用，但是因為你只有做一個稀釋 這樣的數據並不可靠，你應該做個其他稀釋倍數然後取平均值 例如：1/20，1/30，1/50等等 (建議不要做連續稀釋，要分開稀釋不同倍數) 另外，B樣品吸光值由於不落在我做出來區線的吸光值內 也就是說我的曲線吸光值可用區在：0.71155~0.0833 所以不能保證B樣品的濃度可信任，總言之： 我算出來的結果，A樣品的濃度可信度比B樣品高 : 1.想請問因為我IP完後，濃度反而低於IP前，是不是我那一步錯誤， : 這樣正常嗎？ 做IP濃度變低是正常的 畢竟妳去除了一些你不要的蛋白質 加上沉澱再回溶的步驟一定也會有所損失 除非你有做很高倍的濃縮，不然IP只是幫你做類似純化的步驟 : 2.bradford assay測的濃度可以在低嗎？我想建一條standard，濃度到0.0625mg/ml以下 : ，我剛抽出來的protein濃度太稀了，因為這是很重要的sample，又有點趕時間 standard curve的建議很重要 但是如果你的樣品濃度太低我則建議不要稀釋樣品去測 如果可以用BCA就用，個人認為效果比bradford來的精準 另外濃度1對於BCA而言並不會飽和，反倒是濃度2才有機會過飽和 : 3.超級笨問題 先將sample OD帶入趨勢線公式在乘回稀釋倍數， : 還是先將OD*diluent factor? 假設你的回歸公式為：y=ax+b 且一個稀釋N倍的樣品得到的吸光值為y 則樣品原始濃度為：N[(y-b)/a] 利用這個公式你就可以知道實際濃度N[(y-b)/a] 絕對不等於 (Ny-b)/a 所以說，稀釋倍數是最後再乘回去的 : 感激不盡<(_._)> 我建議最好還是重新作一遍蛋白質定量，別浪費這次抽出來的蛋白質 雖然不敢保證我的想法一定全部正確，但可以互相討論 加油~生技的未來要靠大家一起打拼T_T 想說這是一個很好的例子可以讓初學者學會試誤學習 所以花了一些時間整理這個例子中出現的一些盲點 讓原本整個數據好像完全不能採用的情況多一些參考價值 以便下一次再做同樣實驗時可以知道該如何修改實驗的步驟 原po應該還是初學者吧~可以多跟實驗室的學長姐們討論唷^O^ ※ 編輯: sharkcell 來自: 118.160.233.103 (10/11 03:21) ※ 編輯: sharkcell 來自: 118.160.233.103 (10/11 03:27) ※ 編輯: sharkcell 來自: 118.160.233.103 (10/11 03:27)