※ 引述《pent (情人去死)》之铭言： : 抱歉，问个笨问题 : bradford assay测浓度，BSA建standard curve : duplicate,96-well plate : sample 10ul+ 190 bradford reagent : reagent 5倍稀释 : (mg/ml) : sample OD1 OD2 average : 1 1.0329 1.0275 1.0302 : 0.5 0.7091 0.714 0.71155 : 0.25 0.3947 0.439 0.41685 : 0.125 0.209 0.2159 0.21245 : 0.0625 0.0833 0.0659 0.0746 ^^^^^^^^^^ 你都是2倍稀释，中间应该穿插个其他质数倍数的稀释，像是3倍或5倍 : Blank 0.0034 -0.0034 ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ Blank是什麽？空的还是有加buffer？ 目前我做过的实验吸光值是没有负值的，所以我也采用 基本上我会建议Blank要放等体积的Buffer去和Bradford混合 而非单纯只加Bradford，甚至是什麽都不加 以你的实验而言就是10uL sample buffer + 190uL Bradford 我帮你利用你的数值重新算过一次 看图的感觉是浓度1已经饱和了 这也是Bradford常有的问题，浓度1对他而言浓度太高，会低估 所以我将浓度1的这个点去除不拿来作为曲线的参考值 结果为：y = 1.4199x + 0.0211 R平方=0.9849 : 100倍稀释 : sample average conc. : IP 0.0134 0.0118 0.0126 -7.136746 : before 0.0326 0.035 0.0338 -5.095398 : A 0.101 0.1 0.1005 1.327145 : B 0.0675 0.0707 0.0691 -1.696361 : 趋势线的公式：y=0.9629x-0.0835 r square>0.95 ^^^^^^^^^^^^^ 第一点，也是很重要的一个基础点，r平方值要大於0.99 其实你的技术还不差但还需要再以加熟练 但因为你的1/4跟1/16的二重覆相差颇大 我以人工选择的方式利用以下数据作曲线 Standard OD1 OD2 AV 1/2 0.71155 1/4 0.3947 1/8 0.21245 1/16 0.0833 得到结果为：y = 1.4035x + 0.0216 R平方=0.9931 虽然得到漂亮的数值，但是参考的点数太少，基本上还是建议你重做 这个人工筛选是很不得已的情况才做，毕竟是一个很主观的作法 不符合实验需要"客观"的研究跟探讨的态度 第二点，以你的结果数据来看，100倍稀释太多了 (为什麽会说"你的数据"是因为你的算法) 浓度一旦出现负值，一定是你稀释过度 这是一个观念，得到负值时要注意 但是，如果以我帮你重新作出来的数据来算的话结果如下 Sample Av.OD Conc. A 0.1005 5.621660135 B 0.0691 3.384396152 就都是正值啦!! 看起来虽然有数据好像可以使用，但是因为你只有做一个稀释 这样的数据并不可靠，你应该做个其他稀释倍数然後取平均值 例如：1/20，1/30，1/50等等 (建议不要做连续稀释，要分开稀释不同倍数) 另外，B样品吸光值由於不落在我做出来区线的吸光值内 也就是说我的曲线吸光值可用区在：0.71155~0.0833 所以不能保证B样品的浓度可信任，总言之： 我算出来的结果，A样品的浓度可信度比B样品高 : 1.想请问因为我IP完後，浓度反而低於IP前，是不是我那一步错误， : 这样正常吗？ 做IP浓度变低是正常的 毕竟你去除了一些你不要的蛋白质 加上沉淀再回溶的步骤一定也会有所损失 除非你有做很高倍的浓缩，不然IP只是帮你做类似纯化的步骤 : 2.bradford assay测的浓度可以在低吗？我想建一条standard，浓度到0.0625mg/ml以下 : ，我刚抽出来的protein浓度太稀了，因为这是很重要的sample，又有点赶时间 standard curve的建议很重要 但是如果你的样品浓度太低我则建议不要稀释样品去测 如果可以用BCA就用，个人认为效果比bradford来的精准 另外浓度1对於BCA而言并不会饱和，反倒是浓度2才有机会过饱和 : 3.超级笨问题 先将sample OD带入趋势线公式在乘回稀释倍数， : 还是先将OD*diluent factor? 假设你的回归公式为：y=ax+b 且一个稀释N倍的样品得到的吸光值为y 则样品原始浓度为：N[(y-b)/a] 利用这个公式你就可以知道实际浓度N[(y-b)/a] 绝对不等於 (Ny-b)/a 所以说，稀释倍数是最後再乘回去的 : 感激不尽<(_._)> 我建议最好还是重新作一遍蛋白质定量，别浪费这次抽出来的蛋白质 虽然不敢保证我的想法一定全部正确，但可以互相讨论 加油~生技的未来要靠大家一起打拼T_T 想说这是一个很好的例子可以让初学者学会试误学习 所以花了一些时间整理这个例子中出现的一些盲点 让原本整个数据好像完全不能采用的情况多一些参考价值 以便下一次再做同样实验时可以知道该如何修改实验的步骤 原po应该还是初学者吧~可以多跟实验室的学长姐们讨论唷^O^ ※ 编辑: sharkcell 来自: 118.160.233.103 (10/11 03:21) ※ 编辑: sharkcell 来自: 118.160.233.103 (10/11 03:27) ※ 编辑: sharkcell 来自: 118.160.233.103 (10/11 03:27)