作者pozin (阿焦)
看板Biotech
標題[求救] 我的PCR有問題＝ ＝
時間Fri Oct 2 15:25:11 2009
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
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恩...是這樣的
我在放大一段大約3kb的DNA片段
PCR的條件是95度C---5mins
95度C---45sec
58度C---45sec
72度C---1mins
72度C---7mins
可是放大的結果
卻多一條大小大約400bp的band被我放大出來(從gel上很清楚看到）
想說可能是污染到其他東西
我把buffer等等全部換掉
再跑都是多一條band
後來想想,是primer有問題嗎
可是偏偏negative control(沒有加template但其他都有加)完全沒有band
所以想問問大家
有可能在哪裡發生問題？？？？
還是說
可以忽略那多出來的一條band,繼續做下去勒？
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.15.154.12
1F：推 zeroking0519:miss primering?? 定序看看阿~~~ 10/02 15:27
2F：推 egoweaver:non-specific binding?如果只是要cloning的話就切膠純化 10/02 15:28
3F：→ egoweaver:吧，接完再定序。 10/02 15:28
4F：推 howeichu:72度要不要久一點啊? 通常1K一分鐘 10/02 15:36
5F：推 tsubasawolfy:同二樓 另外72度時間看polymerase 例如fusion-tag 10/02 15:57
6F：→ tsubasawolfy:在palsmid上15秒就1kb 10/02 15:58
7F：→ pozin:都忘了說是從plasmid上放大 10/03 00:03
8F：→ pozin:polymerase是Ex-Tag polymerase 10/03 00:04
9F：→ pozin:那如果我把膠切下來再做一次pcr勒 10/03 00:04
10F：推 Cmetallifer:你要不要看看你Taq一分鐘做幾bp啊?? 10/03 01:00
11F：→ Cmetallifer:切下來再跑 很容易糊掉喔 10/03 01:00
12F：推 singren:我倒是覺得還好耶XD" 跟2樓想法一樣~ 10/08 15:27
13F：→ singren:如果真的這樣就算cleanup後再P一次還會有那一條band 10/08 15:28
14F：→ singren:因為我有經驗一一;; 10/08 15:29