作者kgwu (徵5/2 獅象戰內野優待票)
看板Biotech
標題[求救] 以電細胞 (A549) 的方法做Transfection......
時間Wed Sep 30 02:09:39 2009
(代PO)
以下為實驗步驟
1. 八成滿 10cm盤的細胞(A549)，一分四盤
2. 兩天後，每盤細胞數目將近八九成滿
3. 因為測試condition,我就以一盤細胞量 使用一種電壓進行測試 拿pEGEP作為效率指標( 機器設定:70 ms , Pulse:1)
4. Trypsin 細胞一分鐘就可看到細胞掉下來,用含FCS/Antibiotic 回溶，離心
5. 去掉上清液，使用不含FCS/Antibiotic的medium進行wash*2
6. 一個Cuvtte容量是0.6ml 就用不含FCS/Antibiotic 回溶
7. 吸取0.6 ml細胞液,然後放入eppendorf與20ugDNA混合,靜置10min
8. 將細胞液放入已經有冰浴過的Cuvtte,上機電擊
9. 電擊完,靜置10min
10 將Cuvtte中細胞液移入10 cm dish,補含有FCS/Antibiotic的medium
11 隔天觀察: 幾乎活著細胞都沒有發綠光且有4~5成細胞漂浮
問題在是，在Transfection完之後，細胞存活率低，
Transfection效率幾乎是零.....
不知以上步驟是否有可改進之處?
煩請板友指教了@@~謝謝~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 122.117.170.79
1F：推 pent:電壓？時間？ 09/30 08:58
2F：推 leoblack:這叫做electroporation吧~/_\ 09/30 17:29
3F：推 aceliang:buffer可能要翻一下literature，你用什麼機器電？ 09/30 18:24
4F：→ kgwu:電壓 140-185都試過了(每次都試5v特為間隔 )時間:70ms... 09/30 22:59
5F：→ formatin:有一些Protocol 是不建議在電擊的時候加 antibiotics 的 10/02 15:57
6F：→ formatin:另外電擊的效率跟 resuspension buffer 的條件有關 10/02 15:58
7F：→ formatin:可能要先觀察電擊前細胞在 buffer 中的穩定度 10/02 16:02