作者kgwu (徵5/2 狮象战内野优待票)
看板Biotech
标题[求救] 以电细胞 (A549) 的方法做Transfection......
时间Wed Sep 30 02:09:39 2009
(代PO)
以下为实验步骤
1. 八成满 10cm盘的细胞(A549)，一分四盘
2. 两天後，每盘细胞数目将近八九成满
3. 因为测试condition,我就以一盘细胞量 使用一种电压进行测试 拿pEGEP作为效率指标( 机器设定:70 ms , Pulse:1)
4. Trypsin 细胞一分钟就可看到细胞掉下来,用含FCS/Antibiotic 回溶，离心
5. 去掉上清液，使用不含FCS/Antibiotic的medium进行wash*2
6. 一个Cuvtte容量是0.6ml 就用不含FCS/Antibiotic 回溶
7. 吸取0.6 ml细胞液,然後放入eppendorf与20ugDNA混合,静置10min
8. 将细胞液放入已经有冰浴过的Cuvtte,上机电击
9. 电击完,静置10min
10 将Cuvtte中细胞液移入10 cm dish,补含有FCS/Antibiotic的medium
11 隔天观察: 几乎活着细胞都没有发绿光且有4~5成细胞漂浮
问题在是，在Transfection完之後，细胞存活率低，
Transfection效率几乎是零.....
不知以上步骤是否有可改进之处?
烦请板友指教了@@~谢谢~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 122.117.170.79
1F：推 pent:电压？时间？ 09/30 08:58
2F：推 leoblack:这叫做electroporation吧~/_\ 09/30 17:29
3F：推 aceliang:buffer可能要翻一下literature，你用什麽机器电？ 09/30 18:24
4F：→ kgwu:电压 140-185都试过了(每次都试5v特为间隔 )时间:70ms... 09/30 22:59
5F：→ formatin:有一些Protocol 是不建议在电击的时候加 antibiotics 的 10/02 15:57
6F：→ formatin:另外电击的效率跟 resuspension buffer 的条件有关 10/02 15:58
7F：→ formatin:可能要先观察电击前细胞在 buffer 中的稳定度 10/02 16:02