作者airsoda (airsoda)
看板Biotech
標題[方法] 請教做protein concentrate的問題
時間Mon Sep 21 21:29:15 2009
請問有人用過Millipore的microcon做過蛋白質濃縮嗎?
類似Amicon的半透膜產品
我用的是50kDa的
老師想要把protein extraction裡面大於50kDa的蛋白質去掉
但是我用了之後...發現雖然離心後液體有下去
跑PAGE後發現蛋白質都留在上面 完全沒有下去
請問問題出在哪? 目前傾向protein extraction太濃(3.8 g/l)
我的做法是 用RIPA抽蛋白質
取400放在50kDa的microcon上面的column
14000rpm,10分鐘,4度C離心
理論上上層液為大於50kDa的蛋白質
下層液為小於50kDa的蛋白質
但是結果下層什麼東西都沒有
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◆ From: 118.171.195.147
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1F：→ turtle24:嗯 我也有類似的問題 小於孔徑的全留在上面 09/21 21:51
2F：→ missoul:如果備兩支(50&3.5)用洗的收集下來然後再濃縮呢... 09/21 22:17
3F：推 damyr:蛋白質有結構就不會下去，把PH值調到2 or 11是個方法 09/22 00:58
4F：推 wensing:這問題我遇過 我的心得結論是蛋白質太濃，要大量稀釋操作 09/22 13:00
5F：→ wensing:至於要多少濃度... 這要try一下 09/22 13:00
6F：→ wensing:另外，轉速 不能太高..... 09/22 13:01
7F：推 crazybrian:protein可能是monomer or oligomer，所以看分子量不一 09/22 13:58
8F：→ crazybrian:定準確! 09/22 13:58
9F：推 Fourfish:推樓上 另外膜孔很容易被塞住 所以小的不見得過的去 09/22 16:09
10F：→ Fourfish:而且這產品設計用來"濃縮" 不保證可依分子量分開蛋白質@@ 09/22 16:10
11F：→ airsoda:請問轉速大概降到多少 10000rpm可以嗎? 09/22 16:26
12F：推 littlelizard:我參加過他們半的workshop 這是因為被大分子的塞住 09/22 23:16
13F：→ littlelizard:孔洞 大分子在離心時沉降比較快 很容易塞住 個人經驗 09/22 23:18
14F：→ littlelizard:是小分子的還是過的去 可是超少 做膠體過濾吧 09/22 23:20
15F：推 mea7211:降低轉數 提高時間 我記得說明書上建議的轉數/時間和你的 09/26 01:38
16F：→ mea7211:差很多…不同轉速適合分離不同大小的片段 不是什麼東西都 09/26 01:39
17F：→ mea7211:適用高轉速的 09/26 01:40
18F：→ mea7211:濃度太高也可能是問題 孔洞一下就會卡住 09/26 01:41
19F：→ ZecAhau:用RIPA的話，你的lysate可能會太黏而無法穿過膜... 09/29 01:11