作者airsoda (airsoda)
看板Biotech
标题[方法] 请教做protein concentrate的问题
时间Mon Sep 21 21:29:15 2009
请问有人用过Millipore的microcon做过蛋白质浓缩吗?
类似Amicon的半透膜产品
我用的是50kDa的
老师想要把protein extraction里面大於50kDa的蛋白质去掉
但是我用了之後...发现虽然离心後液体有下去
跑PAGE後发现蛋白质都留在上面 完全没有下去
请问问题出在哪? 目前倾向protein extraction太浓(3.8 g/l)
我的做法是 用RIPA抽蛋白质
取400放在50kDa的microcon上面的column
14000rpm,10分钟,4度C离心
理论上上层液为大於50kDa的蛋白质
下层液为小於50kDa的蛋白质
但是结果下层什麽东西都没有
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◆ From: 118.171.195.147
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1F：→ turtle24:嗯 我也有类似的问题 小於孔径的全留在上面 09/21 21:51
2F：→ missoul:如果备两支(50&3.5)用洗的收集下来然後再浓缩呢... 09/21 22:17
3F：推 damyr:蛋白质有结构就不会下去，把PH值调到2 or 11是个方法 09/22 00:58
4F：推 wensing:这问题我遇过 我的心得结论是蛋白质太浓，要大量稀释操作 09/22 13:00
5F：→ wensing:至於要多少浓度... 这要try一下 09/22 13:00
6F：→ wensing:另外，转速 不能太高..... 09/22 13:01
7F：推 crazybrian:protein可能是monomer or oligomer，所以看分子量不一 09/22 13:58
8F：→ crazybrian:定准确! 09/22 13:58
9F：推 Fourfish:推楼上 另外膜孔很容易被塞住 所以小的不见得过的去 09/22 16:09
10F：→ Fourfish:而且这产品设计用来"浓缩" 不保证可依分子量分开蛋白质@@ 09/22 16:10
11F：→ airsoda:请问转速大概降到多少 10000rpm可以吗? 09/22 16:26
12F：推 littlelizard:我参加过他们半的workshop 这是因为被大分子的塞住 09/22 23:16
13F：→ littlelizard:孔洞 大分子在离心时沉降比较快 很容易塞住 个人经验 09/22 23:18
14F：→ littlelizard:是小分子的还是过的去 可是超少 做胶体过滤吧 09/22 23:20
15F：推 mea7211:降低转数 提高时间 我记得说明书上建议的转数/时间和你的 09/26 01:38
16F：→ mea7211:差很多…不同转速适合分离不同大小的片段 不是什麽东西都 09/26 01:39
17F：→ mea7211:适用高转速的 09/26 01:40
18F：→ mea7211:浓度太高也可能是问题 孔洞一下就会卡住 09/26 01:41
19F：→ ZecAhau:用RIPA的话，你的lysate可能会太黏而无法穿过膜... 09/29 01:11