作者raxjimmy (反串正夯)
看板Biotech
標題[求救] 3'RACE的瓶頸
時間Mon Sep 14 18:21:15 2009
夾一個基因的mRNA已經夾四個月了.....
目前已經夾到一個片段
用那個片段做了兩條primer來做3'RACE
一般在做3'RACE的時候第一股cDNA都是用oligo dT去做RTPCR
之後得到的cDNA再用specific primer 和 dT 去夾
我做RTPCR的條件是25度 5min => 42度 60min => 72度 15min
之前是因為還沒有夾到RNA的sequence
所以之後PCR的部分是用degenerated primer夾我要的RNA squence
也順利夾到了預期大小的片段 之後做aligment 也確定是我要的基因沒錯
但是現在麻煩的來了
原本以為接下來做RACE用的primer是專一性的 應該會好做很多
可是接下來怎麼P都是smear
溫度換過了 我也有試過DMSO 然後也買了其他的Taq試過
但是怎麼夾都是那樣
如果之前可以夾到片段 表示RTPCR應該是沒問題
PCR的條件用94 42-62 72
aneal的溫度只要低於50大概就看不到東西了
高於50一直到59都是smear.....
而且最扯的是第一次的35cycle完全看不到產物
要取1ul出來重新再P 35cycle才看的到
RNA的品質我用之前那一組degenerated primer驗收過沒有問題
那...RNA沒問題 RTPCR沒問題
就是PCR的問題摟...
那我的PCR哪邊出了問題呢?
各種條件都換過了
primer在RT也驗證過是可用的
forward 也是同一家公司出品 品質應該無慮
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.13.115.38
1F：→ sGoat:primer頭或尾延長幾個mer使其Tm接近55度,計算一下dimer狀況 09/15 14:24
2F：→ sGoat:P2次35cycle才看到的訊號可信度非常低... 09/15 14:28
3F：→ raxjimmy:換了FINNZYMES的phusion polymerase可以35cycle一次批出 09/17 21:55
4F：→ raxjimmy:smear 但是還是無法解決smear的狀況...囧 09/17 21:55
5F：→ sGoat:smear的問題通常是primer設計不良,或template結構太差... 09/18 09:09
6F：→ sGoat:換polymerase有時會變成反效果,放大出不應該有的片段... 09/18 09:10
7F：→ sGoat:好的primer會p出專一band,次之的出現多條sharp band... 09/18 09:11
8F：→ sGoat:smear的話跟亂槍打鳥一樣... 09/18 09:13
9F：推 blueashin:你用dT當作primer可能專一性會很差.. 12/11 16:26
10F：→ blueashin:建議再dT後面加上一些專一性的序列,作為轉RT時的primer 12/11 16:27
11F：→ blueashin:這樣一來就可以用你加上去的序列來做pcr 12/11 16:27