作者raxjimmy (反串正夯)
看板Biotech
标题[求救] 3'RACE的瓶颈
时间Mon Sep 14 18:21:15 2009
夹一个基因的mRNA已经夹四个月了.....
目前已经夹到一个片段
用那个片段做了两条primer来做3'RACE
一般在做3'RACE的时候第一股cDNA都是用oligo dT去做RTPCR
之後得到的cDNA再用specific primer 和 dT 去夹
我做RTPCR的条件是25度 5min => 42度 60min => 72度 15min
之前是因为还没有夹到RNA的sequence
所以之後PCR的部分是用degenerated primer夹我要的RNA squence
也顺利夹到了预期大小的片段 之後做aligment 也确定是我要的基因没错
但是现在麻烦的来了
原本以为接下来做RACE用的primer是专一性的 应该会好做很多
可是接下来怎麽P都是smear
温度换过了 我也有试过DMSO 然後也买了其他的Taq试过
但是怎麽夹都是那样
如果之前可以夹到片段 表示RTPCR应该是没问题
PCR的条件用94 42-62 72
aneal的温度只要低於50大概就看不到东西了
高於50一直到59都是smear.....
而且最扯的是第一次的35cycle完全看不到产物
要取1ul出来重新再P 35cycle才看的到
RNA的品质我用之前那一组degenerated primer验收过没有问题
那...RNA没问题 RTPCR没问题
就是PCR的问题搂...
那我的PCR哪边出了问题呢?
各种条件都换过了
primer在RT也验证过是可用的
forward 也是同一家公司出品 品质应该无虑
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.13.115.38
1F：→ sGoat:primer头或尾延长几个mer使其Tm接近55度,计算一下dimer状况 09/15 14:24
2F：→ sGoat:P2次35cycle才看到的讯号可信度非常低... 09/15 14:28
3F：→ raxjimmy:换了FINNZYMES的phusion polymerase可以35cycle一次批出 09/17 21:55
4F：→ raxjimmy:smear 但是还是无法解决smear的状况...囧 09/17 21:55
5F：→ sGoat:smear的问题通常是primer设计不良,或template结构太差... 09/18 09:09
6F：→ sGoat:换polymerase有时会变成反效果,放大出不应该有的片段... 09/18 09:10
7F：→ sGoat:好的primer会p出专一band,次之的出现多条sharp band... 09/18 09:11
8F：→ sGoat:smear的话跟乱枪打鸟一样... 09/18 09:13
9F：推 blueashin:你用dT当作primer可能专一性会很差.. 12/11 16:26
10F：→ blueashin:建议再dT後面加上一些专一性的序列,作为转RT时的primer 12/11 16:27
11F：→ blueashin:这样一来就可以用你加上去的序列来做pcr 12/11 16:27