作者littlelizard (專注)
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標題Re: [討論] His-tag protein 純化問題
時間Sat Sep 12 20:02:41 2009
抱歉這陣子太忙
完全忘記這件事
現在才想到上來
大家真的好熱心
※ 引述《Fourfish (～四條魚～)》之銘言：
: 請教幾個問題：
: 1.你的sample黏不黏(稠)？ 黏的話請加點DNaseI試試看
不黏 我是用Pichia生產胞外的蛋白
將菌體離心之後收上清液
應該沒有DNA的問題
: 2.你產生的protein多不多？濃不濃？
: 我前陣子的經驗是lysate中protein太多
: 一進column就沈澱了 結果就塞管....
: 因為你有濃縮的步驟 所以建議不要把protein濃縮的太濃 不然protein容易沈澱出來
我產生的protein應該算多吧
之前純化完使用 BioRad Protein Assay 的定量法可得 2 mg/mL total 體積約 1 mL
然後 我收下來的上清液除了目標蛋白 幾乎沒有其他雜蛋白
只有AOX這個酵素的band而已
之前我純化幾次的結果是沒有觀察到protein有沉澱的現象
: 3.純化過程所有buffer的pH是否正確、一致？
: 記得要考慮一下protein的pI 不然容易在純化時沈澱
恩 我用的buffer是 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH 7.6
分別含有不同濃度的 imidazole
我目標蛋白的pI大約是6.0
: 4.你在準備(或清洗)column時，將resin沖散後會不會看到resin慢慢聚成數個小團塊？
: 或很多resin會黏附在column壁上？
: 有的話，請一定要做clean up，或許你收的medium中有很多lipid，讓resin容易成團不散
不會耶
我用的medium是 YPM (1% yeast extract, 2% peptone, 1% methanol)
不過這是個很好的學習 以後如果做別的我會注意^^
: 5.你指的"只用三次"是指全新的resin剛用三次？還是舊resin重新packing用三次？
: 如果是舊的，那請clean up。
是新的
我們自己的recharge方式是使用 stripping buffer 將 Ni 洗下來
配方是 Stripping Buffer(20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.4)
之後用dH2O 流洗 再以0.5 倍column 體積的0.1 M NiSO4 將膠體recharge
然後用dH2O再洗 再用binding buffer 去平衡
clean up 的話是參考 Pharmacia 的protocol 但我個人目前還沒有試過
: Clean up的方法不外乎有溫和型：20% EtOH、70% EtOH、1.5M NaCl
: 暴力型：0.1-0.5% detergent、1M NaOH、8M Urea、6M Gua-HCl等
: 和你分享一下我上次的超暴力clean up的protocol：
: (因為塞管lose超多protein所以不爽...)
: 我是用重力法 沒用pump 只是開關全開 流速最大 加pipeting沖散resin
: a. 0.5M NaCl, 50mM EDTA, pH~7.0 column灌滿 (~50mL的colum, resin~2-3mL)
: b. ddH2O 灌滿兩次以上
: c. 0.5M NaCl, 8M Urea, pH~7.0 至少5V 沖散靜置約5-10min
: d. ddH2O 灌滿兩次以上
: e. 0.5M NaCl, 0.5% Triton X-100, pH~7.0 灌滿兩次以上
: (以上步驟部分我有含20mM Tris 你也可以用自己的buffer或PBS)
: f. ddH2O 灌滿兩次
: g. 1M NaOH 灌滿 沖散後浸泡1hr
: h. ddH2O 灌滿兩次以上
: i. 20% EtOH 灌滿一次
: j. ddH2O 灌滿兩次以上
: k. Recharge Ni、重新置換buffer平衡~ 跟新的差不多好用~
: 以上 給你參考 希望對你有幫助...
: ps.請注意~這樣clean up超暴力 效果不錯但resin也很容易掛...
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◆ From: 140.116.94.205
1F：推 biogene:pI和pH是怎麼影響呀?09/05 00:01
2F：→ Fourfish:protein的電性啊09/05 00:22
3F：→ biogene:那是elution buffer跟pI太接近的話不太好嗎?09/05 00:36
4F：→ Fourfish:好或不好可能要視何種蛋白 我們家是會遠離pI 0.5-1以上09/05 00:42
5F：推 wensing:相當爆力！09/05 01:00
6F：推 wensing:我的是直接混合 50mM NaH2PO4 20mM EDTA 7M urea09/05 01:05
7F：→ wensing:1%(w/v) SDS, pH = 4.0 然後直接將resin懸浮與填滿column09/05 01:06
8F：→ wensing:重覆2~3次。 最後，再用大量ddH2O清洗兩次以上，09/05 01:09
9F：→ wensing:然後，用20%酒精保存，等到下次要用時，再recharge Ni+209/05 01:10
10F：→ wensing:與buffer平衡。09/05 01:11
11F：推 wensing:另外，我所有使用的液體，都一定會費工夫地去過0.22um。09/05 01:14
12F：→ wensing:有時候，是配出來的溶液 太髒，存在一些小小小顆粒09/05 01:16
13F：→ wensing:塞住column，導致過不去09/05 01:17
14F：推 wensing:對了，那clean buffer我還有加入10mM β-ME09/05 01:41
我配的所有buffer也都是用過 0.22 um 的 dH2O 去配置
我自己目前對於我上次塞住的結論是: 可能我沒有把他重新suspension 再重新沉降
現在每次用之前都會做這個步驟
目前問題是解決了
很感謝大家熱心的回覆分享經驗
謝謝^^
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學長學長!那邊有飆車族 學長學長!那邊剛好像有女生 學長學長~那邊有人紅燈右轉
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