作者littlelizard (专注)
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标题Re: [讨论] His-tag protein 纯化问题
时间Sat Sep 12 20:02:41 2009
抱歉这阵子太忙
完全忘记这件事
现在才想到上来
大家真的好热心
※ 引述《Fourfish (～四条鱼～)》之铭言：
: 请教几个问题：
: 1.你的sample黏不黏(稠)？ 黏的话请加点DNaseI试试看
不黏 我是用Pichia生产胞外的蛋白
将菌体离心之後收上清液
应该没有DNA的问题
: 2.你产生的protein多不多？浓不浓？
: 我前阵子的经验是lysate中protein太多
: 一进column就沈淀了 结果就塞管....
: 因为你有浓缩的步骤 所以建议不要把protein浓缩的太浓 不然protein容易沈淀出来
我产生的protein应该算多吧
之前纯化完使用 BioRad Protein Assay 的定量法可得 2 mg/mL total 体积约 1 mL
然後 我收下来的上清液除了目标蛋白 几乎没有其他杂蛋白
只有AOX这个酵素的band而已
之前我纯化几次的结果是没有观察到protein有沉淀的现象
: 3.纯化过程所有buffer的pH是否正确、一致？
: 记得要考虑一下protein的pI 不然容易在纯化时沈淀
恩 我用的buffer是 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH 7.6
分别含有不同浓度的 imidazole
我目标蛋白的pI大约是6.0
: 4.你在准备(或清洗)column时，将resin冲散後会不会看到resin慢慢聚成数个小团块？
: 或很多resin会黏附在column壁上？
: 有的话，请一定要做clean up，或许你收的medium中有很多lipid，让resin容易成团不散
不会耶
我用的medium是 YPM (1% yeast extract, 2% peptone, 1% methanol)
不过这是个很好的学习 以後如果做别的我会注意^^
: 5.你指的"只用三次"是指全新的resin刚用三次？还是旧resin重新packing用三次？
: 如果是旧的，那请clean up。
是新的
我们自己的recharge方式是使用 stripping buffer 将 Ni 洗下来
配方是 Stripping Buffer(20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.4)
之後用dH2O 流洗 再以0.5 倍column 体积的0.1 M NiSO4 将胶体recharge
然後用dH2O再洗 再用binding buffer 去平衡
clean up 的话是参考 Pharmacia 的protocol 但我个人目前还没有试过
: Clean up的方法不外乎有温和型：20% EtOH、70% EtOH、1.5M NaCl
: 暴力型：0.1-0.5% detergent、1M NaOH、8M Urea、6M Gua-HCl等
: 和你分享一下我上次的超暴力clean up的protocol：
: (因为塞管lose超多protein所以不爽...)
: 我是用重力法 没用pump 只是开关全开 流速最大 加pipeting冲散resin
: a. 0.5M NaCl, 50mM EDTA, pH~7.0 column灌满 (~50mL的colum, resin~2-3mL)
: b. ddH2O 灌满两次以上
: c. 0.5M NaCl, 8M Urea, pH~7.0 至少5V 冲散静置约5-10min
: d. ddH2O 灌满两次以上
: e. 0.5M NaCl, 0.5% Triton X-100, pH~7.0 灌满两次以上
: (以上步骤部分我有含20mM Tris 你也可以用自己的buffer或PBS)
: f. ddH2O 灌满两次
: g. 1M NaOH 灌满 冲散後浸泡1hr
: h. ddH2O 灌满两次以上
: i. 20% EtOH 灌满一次
: j. ddH2O 灌满两次以上
: k. Recharge Ni、重新置换buffer平衡~ 跟新的差不多好用~
: 以上 给你参考 希望对你有帮助...
: ps.请注意~这样clean up超暴力 效果不错但resin也很容易挂...
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◆ From: 140.116.94.205
1F：推 biogene:pI和pH是怎麽影响呀?09/05 00:01
2F：→ Fourfish:protein的电性啊09/05 00:22
3F：→ biogene:那是elution buffer跟pI太接近的话不太好吗?09/05 00:36
4F：→ Fourfish:好或不好可能要视何种蛋白 我们家是会远离pI 0.5-1以上09/05 00:42
5F：推 wensing:相当爆力！09/05 01:00
6F：推 wensing:我的是直接混合 50mM NaH2PO4 20mM EDTA 7M urea09/05 01:05
7F：→ wensing:1%(w/v) SDS, pH = 4.0 然後直接将resin悬浮与填满column09/05 01:06
8F：→ wensing:重覆2~3次。 最後，再用大量ddH2O清洗两次以上，09/05 01:09
9F：→ wensing:然後，用20%酒精保存，等到下次要用时，再recharge Ni+209/05 01:10
10F：→ wensing:与buffer平衡。09/05 01:11
11F：推 wensing:另外，我所有使用的液体，都一定会费工夫地去过0.22um。09/05 01:14
12F：→ wensing:有时候，是配出来的溶液 太脏，存在一些小小小颗粒09/05 01:16
13F：→ wensing:塞住column，导致过不去09/05 01:17
14F：推 wensing:对了，那clean buffer我还有加入10mM β-ME09/05 01:41
我配的所有buffer也都是用过 0.22 um 的 dH2O 去配置
我自己目前对於我上次塞住的结论是: 可能我没有把他重新suspension 再重新沉降
现在每次用之前都会做这个步骤
目前问题是解决了
很感谢大家热心的回覆分享经验
谢谢^^
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学长学长!那边有飙车族 学长学长!那边刚好像有女生 学长学长~那边有人红灯右转
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