作者pent (情人去死)
看板Biotech
標題Re: [求救] 抽大量plasmid，isopropanol沈澱後看不 …
時間Sat Sep 12 17:52:12 2009
今天再次失敗，沈澱後完全看不到pellet Q.Q
qiagent protocol:
昨天晚上七點搖兩百毫升，今天早上七點來離心收菌，冰-30度C，中午一點半回來抽
收菌6000xg 15mins 兩次
然後離兩個50ml離心管，在用10ml的P1混合成一管，
加10ml P2 上下微搖晃 6次，室溫等5分鐘，整管變深藍色
加10ml P3 (pre-chilled on ice)，倒進過濾裝製裡，等10 mins，
用plunger壓，過濾液，加入2.5ml ER buffer，30 mins on ice，
活化tip-500 DNA binding column by QBT buffer
整個到入tip-500 DNA binding column，wash by QC buffer 30ml*2
elute by QN buffer 15ml，加入isopropanol 10.5ml，RT等10mins
離心11900xg 60mins，--->沒pellet，在底部管壁上沒看到任何白白透明的東西...
唉...已經失敗三次了，到底該怎麼辦
※ 引述《pent (情人去死)》之銘言：
: 我用的是qiagent endofree maxi kit
: 搖200ml的菌量，離心後，把全部的菌量用10ml
: 的p1混合成一管，完成依照他的protocol
: 但是最後，用isopropanol沈澱後，一直都看不到pellet
: 第一次測出來，濃度才9ng/ul，根本是沒有抽到
: 做了兩次，都是這樣的結果Q.Q
: 請問該怎樣確認到底是中間哪步驟出了問題?
: 謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.40.60
1F：→ turtle24:isopropanol後放-20 o/n 再離心看看 09/12 18:29
2F：推 aceliang:樓上+1。或是用2倍體積ethanol+1%Na Acetate其實也可以 09/12 18:40
3F：→ conective:嗯 我用invitrogen的maxi也是isopropano 放-20 09/12 19:55
4F：推 bigcat24:isopropanol會不會太少 不到0.8V 通常我會放0.8~1 V 09/12 20:29
5F：→ bigcat24:-20 可以增加沉澱量唷 但養200ml 照理說DNA量夠多才是 09/12 20:31
6F：→ fungihsu:步驟看起來跟Qiagen的操作是一樣的 要不要試著用傳統方法 09/12 23:25
7F：→ fungihsu:試一下 就是在P3 incubation之後 高速離心取出上清液 09/12 23:26
8F：→ fungihsu:然後加入isopropanl (0.7V) incubate for 10min 高速離心 09/12 23:28
9F：→ fungihsu:Molecular cloning應該會有詳細的protocol 09/12 23:29
10F：→ jsi:考慮是否養菌步驟出了問題 菌是否有長起來 情況好嗎 分一小部 09/13 02:06
11F：→ jsi:份抽mini看看 09/13 02:07
12F：推 lydiayeh:我是抽midi 加了isopropanol是立刻離心耶 說明書寫的 09/13 09:57
13F：→ lydiayeh:我用100ml的菌液抽就可以看到pellet 會不會是菌有問題呀 09/13 09:57
14F：→ rimeni:你的菌沒帶正確的plasmid?用chloroform粗抽菌液的DNA看一下 09/13 17:30
15F：推 icome:也許是菌有問題...重新從transform做起看看 09/15 18:27
16F：→ pent:謝謝各位<(_._)> 09/16 10:11