作者pent (情人去死)
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标题Re: [求救] 抽大量plasmid，isopropanol沈淀後看不 …
时间Sat Sep 12 17:52:12 2009
今天再次失败，沈淀後完全看不到pellet Q.Q
qiagent protocol:
昨天晚上七点摇两百毫升，今天早上七点来离心收菌，冰-30度C，中午一点半回来抽
收菌6000xg 15mins 两次
然後离两个50ml离心管，在用10ml的P1混合成一管，
加10ml P2 上下微摇晃 6次，室温等5分钟，整管变深蓝色
加10ml P3 (pre-chilled on ice)，倒进过滤装制里，等10 mins，
用plunger压，过滤液，加入2.5ml ER buffer，30 mins on ice，
活化tip-500 DNA binding column by QBT buffer
整个到入tip-500 DNA binding column，wash by QC buffer 30ml*2
elute by QN buffer 15ml，加入isopropanol 10.5ml，RT等10mins
离心11900xg 60mins，--->没pellet，在底部管壁上没看到任何白白透明的东西...
唉...已经失败三次了，到底该怎麽办
※ 引述《pent (情人去死)》之铭言：
: 我用的是qiagent endofree maxi kit
: 摇200ml的菌量，离心後，把全部的菌量用10ml
: 的p1混合成一管，完成依照他的protocol
: 但是最後，用isopropanol沈淀後，一直都看不到pellet
: 第一次测出来，浓度才9ng/ul，根本是没有抽到
: 做了两次，都是这样的结果Q.Q
: 请问该怎样确认到底是中间哪步骤出了问题?
: 谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.40.60
1F：→ turtle24:isopropanol後放-20 o/n 再离心看看 09/12 18:29
2F：推 aceliang:楼上+1。或是用2倍体积ethanol+1%Na Acetate其实也可以 09/12 18:40
3F：→ conective:嗯 我用invitrogen的maxi也是isopropano 放-20 09/12 19:55
4F：推 bigcat24:isopropanol会不会太少 不到0.8V 通常我会放0.8~1 V 09/12 20:29
5F：→ bigcat24:-20 可以增加沉淀量唷 但养200ml 照理说DNA量够多才是 09/12 20:31
6F：→ fungihsu:步骤看起来跟Qiagen的操作是一样的 要不要试着用传统方法 09/12 23:25
7F：→ fungihsu:试一下 就是在P3 incubation之後 高速离心取出上清液 09/12 23:26
8F：→ fungihsu:然後加入isopropanl (0.7V) incubate for 10min 高速离心 09/12 23:28
9F：→ fungihsu:Molecular cloning应该会有详细的protocol 09/12 23:29
10F：→ jsi:考虑是否养菌步骤出了问题 菌是否有长起来 情况好吗 分一小部 09/13 02:06
11F：→ jsi:份抽mini看看 09/13 02:07
12F：推 lydiayeh:我是抽midi 加了isopropanol是立刻离心耶 说明书写的 09/13 09:57
13F：→ lydiayeh:我用100ml的菌液抽就可以看到pellet 会不会是菌有问题呀 09/13 09:57
14F：→ rimeni:你的菌没带正确的plasmid?用chloroform粗抽菌液的DNA看一下 09/13 17:30
15F：推 icome:也许是菌有问题...重新从transform做起看看 09/15 18:27
16F：→ pent:谢谢各位<(_._)> 09/16 10:11