作者Fourfish (～四條魚～)
看板Biotech
標題Re: [討論] His-tag protein 純化問題
時間Fri Sep 4 23:58:59 2009
請教幾個問題：
1.你的sample黏不黏(稠)？ 黏的話請加點DNaseI試試看
2.你產生的protein多不多？濃不濃？
我前陣子的經驗是lysate中protein太多
一進column就沈澱了 結果就塞管....
因為你有濃縮的步驟 所以建議不要把protein濃縮的太濃 不然protein容易沈澱出來
3.純化過程所有buffer的pH是否正確、一致？
記得要考慮一下protein的pI 不然容易在純化時沈澱
4.你在準備(或清洗)column時，將resin沖散後會不會看到resin慢慢聚成數個小團塊？
或很多resin會黏附在column壁上？
有的話，請一定要做clean up，或許你收的medium中有很多lipid，讓resin容易成團不散
5.你指的"只用三次"是指全新的resin剛用三次？還是舊resin重新packing用三次？
如果是舊的，那請clean up。
Clean up的方法不外乎有溫和型：20% EtOH、70% EtOH、1.5M NaCl
暴力型：0.1-0.5% detergent、1M NaOH、8M Urea、6M Gua-HCl等
和你分享一下我上次的超暴力clean up的protocol：
(因為塞管lose超多protein所以不爽...)
我是用重力法 沒用pump 只是開關全開 流速最大 加pipeting沖散resin
a. 0.5M NaCl, 50mM EDTA, pH~7.0 column灌滿 (~50mL的colum, resin~2-3mL)
b. ddH2O 灌滿兩次以上
c. 0.5M NaCl, 8M Urea, pH~7.0 至少5V 沖散靜置約5-10min
d. ddH2O 灌滿兩次以上
e. 0.5M NaCl, 0.5% Triton X-100, pH~7.0 灌滿兩次以上
(以上步驟部分我有含20mM Tris 你也可以用自己的buffer或PBS)
f. ddH2O 灌滿兩次
g. 1M NaOH 灌滿 沖散後浸泡1hr
h. ddH2O 灌滿兩次以上
i. 20% EtOH 灌滿一次
j. ddH2O 灌滿兩次以上
k. Recharge Ni、重新置換buffer平衡~ 跟新的差不多好用~
以上 給你參考 希望對你有幫助...
ps.請注意~這樣clean up超暴力 效果不錯但resin也很容易掛...
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.94.205
1F：推 biogene:pI和pH是怎麼影響呀? 09/05 00:01
2F：→ Fourfish:protein的電性啊 09/05 00:22
3F：→ biogene:那是elution buffer跟pI太接近的話不太好嗎? 09/05 00:36
4F：→ Fourfish:好或不好可能要視何種蛋白 我們家是會遠離pI 0.5-1以上 09/05 00:42
5F：推 wensing:相當爆力！ 09/05 01:00
6F：推 wensing:我的是直接混合 50mM NaH2PO4 20mM EDTA 7M urea 09/05 01:05
7F：→ wensing:1%(w/v) SDS, pH = 4.0 然後直接將resin懸浮與填滿column 09/05 01:06
8F：→ wensing:重覆2~3次。 最後，再用大量ddH2O清洗兩次以上， 09/05 01:09
9F：→ wensing:然後，用20%酒精保存，等到下次要用時，再recharge Ni+2 09/05 01:10
10F：→ wensing:與buffer平衡。 09/05 01:11
11F：推 wensing:另外，我所有使用的液體，都一定會費工夫地去過0.22um。 09/05 01:14
12F：→ wensing:有時候，是配出來的溶液 太髒，存在一些小小小顆粒 09/05 01:16
13F：→ wensing:塞住column，導致過不去 09/05 01:17
14F：推 wensing:對了，那clean buffer我還有加入10mM β-ME 09/05 01:41