作者Fourfish (～四条鱼～)
看板Biotech
标题Re: [讨论] His-tag protein 纯化问题
时间Fri Sep 4 23:58:59 2009
请教几个问题：
1.你的sample黏不黏(稠)？ 黏的话请加点DNaseI试试看
2.你产生的protein多不多？浓不浓？
我前阵子的经验是lysate中protein太多
一进column就沈淀了 结果就塞管....
因为你有浓缩的步骤 所以建议不要把protein浓缩的太浓 不然protein容易沈淀出来
3.纯化过程所有buffer的pH是否正确、一致？
记得要考虑一下protein的pI 不然容易在纯化时沈淀
4.你在准备(或清洗)column时，将resin冲散後会不会看到resin慢慢聚成数个小团块？
或很多resin会黏附在column壁上？
有的话，请一定要做clean up，或许你收的medium中有很多lipid，让resin容易成团不散
5.你指的"只用三次"是指全新的resin刚用三次？还是旧resin重新packing用三次？
如果是旧的，那请clean up。
Clean up的方法不外乎有温和型：20% EtOH、70% EtOH、1.5M NaCl
暴力型：0.1-0.5% detergent、1M NaOH、8M Urea、6M Gua-HCl等
和你分享一下我上次的超暴力clean up的protocol：
(因为塞管lose超多protein所以不爽...)
我是用重力法 没用pump 只是开关全开 流速最大 加pipeting冲散resin
a. 0.5M NaCl, 50mM EDTA, pH~7.0 column灌满 (~50mL的colum, resin~2-3mL)
b. ddH2O 灌满两次以上
c. 0.5M NaCl, 8M Urea, pH~7.0 至少5V 冲散静置约5-10min
d. ddH2O 灌满两次以上
e. 0.5M NaCl, 0.5% Triton X-100, pH~7.0 灌满两次以上
(以上步骤部分我有含20mM Tris 你也可以用自己的buffer或PBS)
f. ddH2O 灌满两次
g. 1M NaOH 灌满 冲散後浸泡1hr
h. ddH2O 灌满两次以上
i. 20% EtOH 灌满一次
j. ddH2O 灌满两次以上
k. Recharge Ni、重新置换buffer平衡~ 跟新的差不多好用~
以上 给你参考 希望对你有帮助...
ps.请注意~这样clean up超暴力 效果不错但resin也很容易挂...
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.94.205
1F：推 biogene:pI和pH是怎麽影响呀? 09/05 00:01
2F：→ Fourfish:protein的电性啊 09/05 00:22
3F：→ biogene:那是elution buffer跟pI太接近的话不太好吗? 09/05 00:36
4F：→ Fourfish:好或不好可能要视何种蛋白 我们家是会远离pI 0.5-1以上 09/05 00:42
5F：推 wensing:相当爆力！ 09/05 01:00
6F：推 wensing:我的是直接混合 50mM NaH2PO4 20mM EDTA 7M urea 09/05 01:05
7F：→ wensing:1%(w/v) SDS, pH = 4.0 然後直接将resin悬浮与填满column 09/05 01:06
8F：→ wensing:重覆2~3次。 最後，再用大量ddH2O清洗两次以上， 09/05 01:09
9F：→ wensing:然後，用20%酒精保存，等到下次要用时，再recharge Ni+2 09/05 01:10
10F：→ wensing:与buffer平衡。 09/05 01:11
11F：推 wensing:另外，我所有使用的液体，都一定会费工夫地去过0.22um。 09/05 01:14
12F：→ wensing:有时候，是配出来的溶液 太脏，存在一些小小小颗粒 09/05 01:16
13F：→ wensing:塞住column，导致过不去 09/05 01:17
14F：推 wensing:对了，那clean buffer我还有加入10mM β-ME 09/05 01:41