作者nexusfantasy (白烏鴉)
看板Biotech
標題[求救] Real-Time PCR 結果不穩定
時間Fri Sep 4 01:02:24 2009
小弟最近正在做小鼠脂肪組織的 Real-Time PCR
使用的機器是 Bio-Rad icycler ,SYBR Green Mix 則是 Bio-Rad 原廠
PCR Tube 是 96 well plate 可分成四等份那種 再用 Seal 貼紙封住
小鼠的分組是每組5隻 共4組
跑Real-Time時 也是每組 n=5 共4組 不再做同sample的重複
house keeping gene 是用 HPRT 沒有做 standard curve
跑出來的結果 melting curve 都是 single peak
CT 值也都在 15~30 之間
但是不同組別間 HPRT的表現量常常會差到2~4倍 (也就是CT值差了1~2)
normalized後 traget gene 的表現量差異 幾乎都是因為HPRT的差異造成
error bar也時高時低..
請問這樣的data是否可以相信呢? 應該要怎麼改進?
除此之外 我想請教一些Real-Time PCR loading的技巧
像是如何不產生氣泡 需不需要按到第二段 以及 loading 的順序等等
(我只知道不可以杯壁下流再去離心..Bio-Rad Specialist說的)
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◆ From: 218.160.62.210
※ 編輯: nexusfantasy 來自: 218.160.62.210 (09/04 01:08)
1F：推 iris416:我也想問這個問題~但是我學姐告訴我體積ㄧ定要準~我做二 09/04 16:36
2F：→ iris416:重複,只要pipetteman跑掉一點點~就會差很多... 09/04 16:37
3F：→ iris416:產生氣泡應該還好, 按到第二段以後沿著管壁拉上來~ 09/04 16:38
4F：推 yangkoumi:作real-time盡量不要pipetting 延著管壁接近液體慢慢加 09/04 18:18
5F：→ yangkoumi:另外，可以做3重複 避免偏差太大 09/04 18:18
6F：推 zoom8080:氣泡一加熱應該就會消失了 09/05 15:46
7F：推 sinlu:我以前做都不按到第二段，會pipetting。另外，會稍微spin 09/05 22:17
8F：→ sinlu:down去消氣泡 09/05 22:18
9F：→ tezufuji:pipetting應該沒有影響到很大...氣泡按住TUBE稍微輕彈 09/07 11:24
10F：→ tezufuji:也會消失...建議還是要做二重複比較同一SAMPLE的CT值... 09/07 11:25
11F：→ joey0422:我是用羅氏的LightCycler 廠商說材料一定要混合均勻... 09/07 15:13
12F：→ joey0422:另外至少要做兩重複 三重複則比較保險 去除明顯偏差的值 09/07 15:14
13F：→ logphase:建議先練習作standard curve, R2一定要大於0.99 09/09 17:52
15F：→ sneak: //daxiv.com 01/03 17:00