作者nexusfantasy (白乌鸦)
看板Biotech
标题[求救] Real-Time PCR 结果不稳定
时间Fri Sep 4 01:02:24 2009
小弟最近正在做小鼠脂肪组织的 Real-Time PCR
使用的机器是 Bio-Rad icycler ,SYBR Green Mix 则是 Bio-Rad 原厂
PCR Tube 是 96 well plate 可分成四等份那种 再用 Seal 贴纸封住
小鼠的分组是每组5只 共4组
跑Real-Time时 也是每组 n=5 共4组 不再做同sample的重复
house keeping gene 是用 HPRT 没有做 standard curve
跑出来的结果 melting curve 都是 single peak
CT 值也都在 15~30 之间
但是不同组别间 HPRT的表现量常常会差到2~4倍 (也就是CT值差了1~2)
normalized後 traget gene 的表现量差异 几乎都是因为HPRT的差异造成
error bar也时高时低..
请问这样的data是否可以相信呢? 应该要怎麽改进?
除此之外 我想请教一些Real-Time PCR loading的技巧
像是如何不产生气泡 需不需要按到第二段 以及 loading 的顺序等等
(我只知道不可以杯壁下流再去离心..Bio-Rad Specialist说的)
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 218.160.62.210
※ 编辑: nexusfantasy 来自: 218.160.62.210 (09/04 01:08)
1F：推 iris416:我也想问这个问题~但是我学姐告诉我体积ㄧ定要准~我做二 09/04 16:36
2F：→ iris416:重复,只要pipetteman跑掉一点点~就会差很多... 09/04 16:37
3F：→ iris416:产生气泡应该还好, 按到第二段以後沿着管壁拉上来~ 09/04 16:38
4F：推 yangkoumi:作real-time尽量不要pipetting 延着管壁接近液体慢慢加 09/04 18:18
5F：→ yangkoumi:另外，可以做3重复 避免偏差太大 09/04 18:18
6F：推 zoom8080:气泡一加热应该就会消失了 09/05 15:46
7F：推 sinlu:我以前做都不按到第二段，会pipetting。另外，会稍微spin 09/05 22:17
8F：→ sinlu:down去消气泡 09/05 22:18
9F：→ tezufuji:pipetting应该没有影响到很大...气泡按住TUBE稍微轻弹 09/07 11:24
10F：→ tezufuji:也会消失...建议还是要做二重复比较同一SAMPLE的CT值... 09/07 11:25
11F：→ joey0422:我是用罗氏的LightCycler 厂商说材料一定要混合均匀... 09/07 15:13
12F：→ joey0422:另外至少要做两重复 三重复则比较保险 去除明显偏差的值 09/07 15:14
13F：→ logphase:建议先练习作standard curve, R2一定要大於0.99 09/09 17:52
15F：→ sneak: //daxiv.com 01/03 17:00