作者littlelizard (專注)
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標題[討論] His-tag protein 純化問題
時間Thu Sep 3 17:55:35 2009
大家好
最近都在做蛋白質純化
使用的是 Ni-NTA 來純化帶有 His-tag 的protein
原理和實驗方法我都有從網站上的protocol搞懂了
也有爬過文
目前比較困擾我的事情是
流速會越來越慢......有時候甚至就塞住了 = =
我們家使用的是自己packing膠體
我有照學長說的
每次使用前pipette一下讓他重新packing 以免久了膠體會結塊容易塞住
也照protocol說的
先用水洗掉20%酒精 再用10 mM imidazole 平衡 避免沉澱產生
然後我濃縮置換好的sample在過column前也有過0.45 um膜 以免雜質堵塞膠體
但有時候還是會流速越來越慢
剛甚至在水wash的時候居然就塞住不動了 = =
所以想請教各位前輩
還有什麼可能造成堵塞呢?
我才沒用超過3次
之前的經驗大概流速會是 400~600 uL/min
請大家給我一點建議吧
謝謝
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◆ From: 140.112.74.19
1F：推 turtle24:膠體的說明書應該有clean up的指南吧 09/03 18:14
我們家的膠體不知道是幾百年前買的......沒有說明書
我有看我找的 Invitrogen 和 QUIAGEN 似乎沒有提到堵住的可能原因和處理方法?
2F：推 wensing:將破好菌的粗菌液 以12000~14000rpm 離心 至上清液可被 09/03 18:33
3F：→ wensing:0.22um的小飛碟 過濾。 09/03 18:35
4F：→ wensing:若無法完全過濾，則繼續離心。 以上是我的方式 參考看看 09/03 18:37
我是以Pichia生產胞外蛋白 不用破菌 所以離心收上清液後就濃縮 置換buffer
過 0.45 um 之前過 0.22 um 覺得跟 0.45 um 差異不大 所以後來都用 0.45 um
5F：→ wensing:另外，將管柱先以水流看看(不含resin)是否已經被堵住 09/03 18:39
6F：推 wensing:若堵住，在管柱可容許的條件下，用力清洗 09/03 18:42
7F：→ wensing:讓管柱 跟 剛買來 沒用 過一樣的順暢 09/03 18:44
8F：→ wensing:我常用是用輪流用清潔劑、95%酒精 去超音波震盪 09/03 18:45
喔ˊ 這的確有可能 好我會試試看 謝謝你
9F：→ wensing:若是DNA的話，好像先前版友有提到，用DNase去處理 09/03 18:47
10F：推 turtle24:1M NaOH -> binding buffer -> 1.5M NaCl ->ddH2O 大致 09/03 22:11
11F：→ turtle24:體積我都抓5V 試試囉 09/03 22:12
這是指clean up 嗎?
使用時機是......?
而且用NaOH wash 的話要調回pH不是會用到很大量的buffer嗎?
※ 編輯: littlelizard 來自: 61.224.33.17 (09/04 01:50)
12F：推 turtle24:液體都是流過去殘留很少 pH還好吧 最後一步是大量的ddw 09/04 04:14