作者littlelizard (专注)
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标题[讨论] His-tag protein 纯化问题
时间Thu Sep 3 17:55:35 2009
大家好
最近都在做蛋白质纯化
使用的是 Ni-NTA 来纯化带有 His-tag 的protein
原理和实验方法我都有从网站上的protocol搞懂了
也有爬过文
目前比较困扰我的事情是
流速会越来越慢......有时候甚至就塞住了 = =
我们家使用的是自己packing胶体
我有照学长说的
每次使用前pipette一下让他重新packing 以免久了胶体会结块容易塞住
也照protocol说的
先用水洗掉20%酒精 再用10 mM imidazole 平衡 避免沉淀产生
然後我浓缩置换好的sample在过column前也有过0.45 um膜 以免杂质堵塞胶体
但有时候还是会流速越来越慢
刚甚至在水wash的时候居然就塞住不动了 = =
所以想请教各位前辈
还有什麽可能造成堵塞呢?
我才没用超过3次
之前的经验大概流速会是 400~600 uL/min
请大家给我一点建议吧
谢谢
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◆ From: 140.112.74.19
1F：推 turtle24:胶体的说明书应该有clean up的指南吧 09/03 18:14
我们家的胶体不知道是几百年前买的......没有说明书
我有看我找的 Invitrogen 和 QUIAGEN 似乎没有提到堵住的可能原因和处理方法?
2F：推 wensing:将破好菌的粗菌液 以12000~14000rpm 离心 至上清液可被 09/03 18:33
3F：→ wensing:0.22um的小飞碟 过滤。 09/03 18:35
4F：→ wensing:若无法完全过滤，则继续离心。 以上是我的方式 参考看看 09/03 18:37
我是以Pichia生产胞外蛋白 不用破菌 所以离心收上清液後就浓缩 置换buffer
过 0.45 um 之前过 0.22 um 觉得跟 0.45 um 差异不大 所以後来都用 0.45 um
5F：→ wensing:另外，将管柱先以水流看看(不含resin)是否已经被堵住 09/03 18:39
6F：推 wensing:若堵住，在管柱可容许的条件下，用力清洗 09/03 18:42
7F：→ wensing:让管柱 跟 刚买来 没用 过一样的顺畅 09/03 18:44
8F：→ wensing:我常用是用轮流用清洁剂、95%酒精 去超音波震荡 09/03 18:45
喔ˊ 这的确有可能 好我会试试看 谢谢你
9F：→ wensing:若是DNA的话，好像先前版友有提到，用DNase去处理 09/03 18:47
10F：推 turtle24:1M NaOH -> binding buffer -> 1.5M NaCl ->ddH2O 大致 09/03 22:11
11F：→ turtle24:体积我都抓5V 试试罗 09/03 22:12
这是指clean up 吗?
使用时机是......?
而且用NaOH wash 的话要调回pH不是会用到很大量的buffer吗?
※ 编辑: littlelizard 来自: 61.224.33.17 (09/04 01:50)
12F：推 turtle24:液体都是流过去残留很少 pH还好吧 最後一步是大量的ddw 09/04 04:14