作者takkyu (心情真好~)
看板Biotech
標題[求救] 免疫螢光染色
時間Thu Aug 27 23:42:36 2009
各位大家好，想請問大家我這樣的染色步驟是否可行
因為出來的結果有時候成功有時候又失敗
以染NeuN為例好了 [Chemicon, MAB377, Ms]
1. Slide 56~60度西 x 15分鐘
2. Slide 浸泡 xylene 5分鐘 x 2 --> 100%酒精 3分鐘 --> 95% 酒精 3分鐘
--> 80% 酒精 3分鐘 --> H2O 30秒
3. PBS wash 5分鐘
4. Blocking 2小時 [PBS + 10% Normal goat serum + 1% BSA + 1% Triton X-100]
5. 不wash 將blocking solution敲乾淨
6. 加入一抗 [PBS + 2% Normal goat serum + 0.2% Triton x-100] overnight
7. Wash PBS 5分鐘 x 2
8. 加入螢光二抗 [避光，配方同一抗] (invitrogen Alexa Fluor系列)
9. Wash PBS 5分鐘 x 2 [避光]
10. 滴anti-fade 封片 [避光]
想詢問各為這樣的protocol是否可行，我在做的時候有確定不是因為片子乾掉
而造成失敗~
另外想請問各位的是PBS配方
我們家的是 0.01M PBS(2L): 1.8 NaCl; 0.432 NaH2PO4; 2.16 Na2HPO4; PH7.4
我另外有要到
1. (1L)dH2O 800ml; NaCl 8g; KCl 1.2g; Na2HPO4 1.44g; KH2PO4 0.24g pH7.4
2. 0.1M PBS(2L): 18.4g Na2HPO4; 17.5g NaCl; 5.04g NaH2PO4． H2O; 0.4g KCl
這兩種，想請問這兩種的差別是有聽說1.是用在活細胞 2.就不知道了；哪種配方
是比較適合用在免疫染色上(組織)
先謝謝各位了，若改善後有結果會在上來跟各位分享步驟~
祝各位 實驗順利!!
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※ 編輯: takkyu 來自: 125.225.149.70 (08/27 23:43)
1F：→ takkyu:另外想請問雙染的話需要注意哪些地方呢? 08/28 00:10
2F：→ humwang:沒有做antigen retrival, antigen沒暴露出來，當然沒結果 08/30 19:07
3F：→ humwang:rehydration後用citric buffer做antigen retrival 08/30 19:09