作者s90034 (請勿拍打餵食！)
看板Biotech
標題[求救] western訊號強弱不同
時間Thu Aug 20 14:35:36 2009
因為老闆說要比較protein的量
因此要測B-actin的量
把之前壓好的4片membrane拿出來wash(洗掉HRP)
之後按照一般程序
> 一抗(1:10000)室溫1小時
> wash
> 二抗(1:5000)室溫2小時
> wash
> HRP
> 壓片
但是壓出來後卻有很大的問題......
4片有3片看起來很正常(至少band都夠粗夠黑)
但其中一片band卻很淡
想說把壓片時間拉長看看
結果其他三片更粗了...那一片卻幾乎看不到了囧
看一下之前壓目標protein的片子
那一片看起來的確有比其他片淡一些
不過"肉眼"看來應該沒差這麼多@@
因為是整片10條band都很淡，所以應該不會是個別sample的問題
而blocking、一抗、二抗都是先配在同一管再分成4份
應該也不會是這些原因
我在想因為我們家用的是溼式transfer
放法是: 正 菜瓜布>3M3張>membrane>gel>3M3張>菜瓜布 負
因為菜瓜布用久了每片厚度不一
雖然覺得因為這樣造成transfer效率的問題
但是這可能會造成這麼大的差異嗎= =?
請問可能還會有什麼原因會造成如此問題?
而且HRP壓越久反而越看不到會是什麼原因呢?
感謝O_Q
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◆ From: 211.76.175.171
1F：推 ooooh:signal太強 decay過快 08/20 21:11
2F：→ s90034:可是同樣的sample卻是相反的結果...一片愈強一愈弱弱~"~ 08/20 22:51