作者glencan (為了更好的未來)
看板Biotech
標題Re: [求救] SDS-PAGE時sample聚焦的效果很糟
時間Tue Aug 18 23:34:33 2009
※ 引述《egoweaver (Hiko)》之銘言：
: 最近在跑膠的時候一直有這個問題。查了一些資料都指向是因為buffer pH的問題，但是實
: 驗室裡其他人用同一組buffer來鑄膠卻沒有發生類似的問題，所以自己檢討一下覺得比較
: 可能出問題的有以下幾點:
: 1.配膠的時候mix不均勻
: 2.為了怕上膠因為漏掉而有well塌掉所以用了配方的兩倍的APS和TEMED(希望它快點凝)
: 3.完全是操作者的技術問題，大概是哪裡出包而且還沒看出來……
: 想請問以上有哪些可能會使sample不會乖乖停在上下膠交界的。
: btw,我跑膠是用65V(35min)-120V(跑到dye跳海)，最近每次timer響要過去看的時候sample
: 和marker都已經衝過去了……
恩逗...sample無法聚焦我以前也有遇過...
那時候是因為跑的太久了糊掉.
也有另一個可能是跑太快(電流太高),
在stacking的部分就沒有跑好,所以後來band就會糊糊的.
另外,請問一下原po,你們load都是同樣量的蛋白質嗎?
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關於2.
AP粉量太多好像會造成蛋白質無法分離均勻是不是? 還是我記錯了 @@
怕上膠漏掉~我的做法是,在配的時候先把spacer填滿,滿到快要溢出來那樣,
大概等個1~3分鐘,再把comb放上去.
(別等太久,不然等膠有點凝的時候再放comb,well會很難看)
或者,也可以把轉漬後的膠拿去stain,看看是不是只有全部的band都是這樣,
還是只有single band有這樣的狀況...
以上是我有遇過的狀況以及我的解決方法,如果有錯誤也歡迎各位一起討論啦 ^^a
因為我也想知道有哪些解決方法的說
===============================以下提外話==================================
關於之前提到的組織做western,目前改善多了...(不過還有很多的進步空間 = ==)
就...sonicate久一點這樣...(疑似染色體DNA搞的鬼 == ==+)
然後RIPA的量也加多一些,去稀釋它的濃度...
總之,現在western比較能看了,不過band還是滿糊的,
要修正的還很多...唉唉唉 Q皿Q
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◆ From: 140.127.227.179
1F：推 egoweaver:Loading的量是一致的。跑出來的band的其實是還好，可是 08/18 23:42
2F：→ egoweaver:以往跑的時候都會很明顯的感覺到dye在交界處停住一陣子 08/18 23:42
3F：→ egoweaver:直到把電壓調大才會繼續跑，可是現在就直接衝過去，band 08/18 23:43
4F：→ egoweaver:也變得比較糊了，因為電壓都是用一樣的，所以應該不是電 08/18 23:43
5F：→ egoweaver:流電壓的問題。 08/18 23:43
6F：推 yangkoumi:再跑之前你是否有坐蛋白質的定量? 確定sample沒有問題? 08/19 21:12
7F：→ yangkoumi:以6M Urea溶樣品是OK的 因為我也跑得出來 08/19 21:14
8F：推 yangkoumi:如果問題是出在高鹽的話可考慮TCA/Acetone沉澱 08/19 21:16
9F：推 egoweaver:在urea裡不能做commassie blue的protein assay吧……所 08/19 21:41
10F：→ egoweaver:以我破完菌然後denature overnight就直接跑了QQ 08/19 21:41
11F：推 potato0414:running buffer不要reuse 09/17 00:46