作者glencan (为了更好的未来)
看板Biotech
标题Re: [求救] SDS-PAGE时sample聚焦的效果很糟
时间Tue Aug 18 23:34:33 2009
※ 引述《egoweaver (Hiko)》之铭言：
: 最近在跑胶的时候一直有这个问题。查了一些资料都指向是因为buffer pH的问题，但是实
: 验室里其他人用同一组buffer来铸胶却没有发生类似的问题，所以自己检讨一下觉得比较
: 可能出问题的有以下几点:
: 1.配胶的时候mix不均匀
: 2.为了怕上胶因为漏掉而有well塌掉所以用了配方的两倍的APS和TEMED(希望它快点凝)
: 3.完全是操作者的技术问题，大概是哪里出包而且还没看出来……
: 想请问以上有哪些可能会使sample不会乖乖停在上下胶交界的。
: btw,我跑胶是用65V(35min)-120V(跑到dye跳海)，最近每次timer响要过去看的时候sample
: 和marker都已经冲过去了……
恩逗...sample无法聚焦我以前也有遇过...
那时候是因为跑的太久了糊掉.
也有另一个可能是跑太快(电流太高),
在stacking的部分就没有跑好,所以後来band就会糊糊的.
另外,请问一下原po,你们load都是同样量的蛋白质吗?
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关於2.
AP粉量太多好像会造成蛋白质无法分离均匀是不是? 还是我记错了 @@
怕上胶漏掉~我的做法是,在配的时候先把spacer填满,满到快要溢出来那样,
大概等个1~3分钟,再把comb放上去.
(别等太久,不然等胶有点凝的时候再放comb,well会很难看)
或者,也可以把转渍後的胶拿去stain,看看是不是只有全部的band都是这样,
还是只有single band有这样的状况...
以上是我有遇过的状况以及我的解决方法,如果有错误也欢迎各位一起讨论啦 ^^a
因为我也想知道有哪些解决方法的说
===============================以下提外话==================================
关於之前提到的组织做western,目前改善多了...(不过还有很多的进步空间 = ==)
就...sonicate久一点这样...(疑似染色体DNA搞的鬼 == ==+)
然後RIPA的量也加多一些,去稀释它的浓度...
总之,现在western比较能看了,不过band还是满糊的,
要修正的还很多...唉唉唉 Q皿Q
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.127.227.179
1F：推 egoweaver:Loading的量是一致的。跑出来的band的其实是还好，可是 08/18 23:42
2F：→ egoweaver:以往跑的时候都会很明显的感觉到dye在交界处停住一阵子 08/18 23:42
3F：→ egoweaver:直到把电压调大才会继续跑，可是现在就直接冲过去，band 08/18 23:43
4F：→ egoweaver:也变得比较糊了，因为电压都是用一样的，所以应该不是电 08/18 23:43
5F：→ egoweaver:流电压的问题。 08/18 23:43
6F：推 yangkoumi:再跑之前你是否有坐蛋白质的定量? 确定sample没有问题? 08/19 21:12
7F：→ yangkoumi:以6M Urea溶样品是OK的 因为我也跑得出来 08/19 21:14
8F：推 yangkoumi:如果问题是出在高盐的话可考虑TCA/Acetone沉淀 08/19 21:16
9F：推 egoweaver:在urea里不能做commassie blue的protein assay吧……所 08/19 21:41
10F：→ egoweaver:以我破完菌然後denature overnight就直接跑了QQ 08/19 21:41
11F：推 potato0414:running buffer不要reuse 09/17 00:46