作者Fourfish (～四條魚～)
看板Biotech
標題[討論] 請教大體積的蛋白質表現
時間Mon Aug 17 20:52:15 2009
各位好
我目前在學習重組蛋白質的表現與純化
Host為E. coli (BL21 DE3, B834, Rosetta等strain)
最近常發生一個問題...
在做小量(~3ml LB)的蛋白質表現測試的時候 (抓表現的condition，包括溫度、OD、時間、IPTG)
可看到蛋白質表現的不錯
不過以同樣condition 將culture體積放大到~1或2L時
蛋白質表現量就會變得少 有時候甚至沒有表現
這樣表現時好時壞 讓人蠻頭痛的...
所以想請教有相關經驗的前輩
還有什麼因素是需要注意的嘛？
或者可以分享作法讓我參考及修改嘛？
希望能和各位討論討論 謝謝！
Vector: pET系列
Tag: 6xHis
以下是我目前的作法 [一些查到或打聽到的方法]
1. 沾取一點glycerol stock接種於LB(+antibiotics)中 37度 O/N culture 12-16hr
[a.有人建議不要用glycerol stock做start culture，至少用plate劃開挑single colony]
[b.從transformation做起]
2. 1 liter新鮮的LB(+antibiotics)加入10ml的O/N culture 37度 培養至OD ~0.4-0.6
[a.培養基要pre-warm]
[b.逐步放大體積 例如3ml -> 20ml -> 1L 以保持菌新鮮]
3. 調整溫度、加入1-0.5mM IPTG
[a.調整溫度後約10-20min 待適應溫度後再加IPTG]
4. 表現3-5hr 收菌 以SDS-PAGE確認蛋白質表現
對於我的作法和我打聽到的一些方法
希望大家給我一點意見 謝謝！
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◆ From: 140.116.94.204
※ 編輯: Fourfish 來自: 140.116.94.204 (08/17 20:54)
1F：推 jykonv23:加IPTG 調整溫度是調到多少? 08/18 14:03
2F：→ Fourfish:我有幾個不同protein 表現要在28度 25度都有 08/18 14:19
3F：→ ambercandy:IPTG 等OD值到0.6在加入，太早加菌會來不及表現 08/18 22:18
4F：推 xenosdk:我的想法是 0.6 之後又花10-20 分鐘調溫度 這樣很有可能 08/19 12:06
5F：→ xenosdk:bacteria長太多了吧 試試看早一點調溫度 0.6左右就加IPTG 08/19 12:08
6F：→ xenosdk:試試看 08/19 12:08
7F：→ xenosdk:0.2, 0.3左右就改溫度, 讓他長到~0.6加IPTG 08/19 12:12
8F：→ xenosdk:如果嫌低溫長太慢.. O/N culture可以用大一點的量(10-50ml 08/19 12:13
9F：→ Fourfish:謝樓上各位 今天試試看 08/19 12:47
10F：→ crazybrian:氧氣不足 08/19 19:10
11F：推 zeratul1396:同意樓上... 08/20 11:31
12F：→ Fourfish:我用6L flask養1-2L culture 搖180-200rpm 氧氣會不足嘛? 08/20 20:07
13F：→ Fourfish:重新transformation就恢復了 看來最好每次都重新cloning 09/05 14:59