作者Fourfish (～四条鱼～)
看板Biotech
标题[讨论] 请教大体积的蛋白质表现
时间Mon Aug 17 20:52:15 2009
各位好
我目前在学习重组蛋白质的表现与纯化
Host为E. coli (BL21 DE3, B834, Rosetta等strain)
最近常发生一个问题...
在做小量(~3ml LB)的蛋白质表现测试的时候 (抓表现的condition，包括温度、OD、时间、IPTG)
可看到蛋白质表现的不错
不过以同样condition 将culture体积放大到~1或2L时
蛋白质表现量就会变得少 有时候甚至没有表现
这样表现时好时坏 让人蛮头痛的...
所以想请教有相关经验的前辈
还有什麽因素是需要注意的嘛？
或者可以分享作法让我参考及修改嘛？
希望能和各位讨论讨论 谢谢！
Vector: pET系列
Tag: 6xHis
以下是我目前的作法 [一些查到或打听到的方法]
1. 沾取一点glycerol stock接种於LB(+antibiotics)中 37度 O/N culture 12-16hr
[a.有人建议不要用glycerol stock做start culture，至少用plate划开挑single colony]
[b.从transformation做起]
2. 1 liter新鲜的LB(+antibiotics)加入10ml的O/N culture 37度 培养至OD ~0.4-0.6
[a.培养基要pre-warm]
[b.逐步放大体积 例如3ml -> 20ml -> 1L 以保持菌新鲜]
3. 调整温度、加入1-0.5mM IPTG
[a.调整温度後约10-20min 待适应温度後再加IPTG]
4. 表现3-5hr 收菌 以SDS-PAGE确认蛋白质表现
对於我的作法和我打听到的一些方法
希望大家给我一点意见 谢谢！
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.94.204
※ 编辑: Fourfish 来自: 140.116.94.204 (08/17 20:54)
1F：推 jykonv23:加IPTG 调整温度是调到多少? 08/18 14:03
2F：→ Fourfish:我有几个不同protein 表现要在28度 25度都有 08/18 14:19
3F：→ ambercandy:IPTG 等OD值到0.6在加入，太早加菌会来不及表现 08/18 22:18
4F：推 xenosdk:我的想法是 0.6 之後又花10-20 分钟调温度 这样很有可能 08/19 12:06
5F：→ xenosdk:bacteria长太多了吧 试试看早一点调温度 0.6左右就加IPTG 08/19 12:08
6F：→ xenosdk:试试看 08/19 12:08
7F：→ xenosdk:0.2, 0.3左右就改温度, 让他长到~0.6加IPTG 08/19 12:12
8F：→ xenosdk:如果嫌低温长太慢.. O/N culture可以用大一点的量(10-50ml 08/19 12:13
9F：→ Fourfish:谢楼上各位 今天试试看 08/19 12:47
10F：→ crazybrian:氧气不足 08/19 19:10
11F：推 zeratul1396:同意楼上... 08/20 11:31
12F：→ Fourfish:我用6L flask养1-2L culture 摇180-200rpm 氧气会不足嘛? 08/20 20:07
13F：→ Fourfish:重新transformation就恢复了 看来最好每次都重新cloning 09/05 14:59