作者glencan (為了更好的未來)
看板Biotech
標題[求救] 組織均質後做western
時間Wed Aug 12 01:15:14 2009
最近取大鼠的肌肉組織,均質(homogenize)後定量進行western看蛋白質表現
電泳時遇到一個問題,
sample很濃稠,要load進well的時候好像"思樂冰"一樣勾勾的,
電泳後膠的well上也有一點點殘留物(不知道是什麼)
洗片後也是白皙皙 QQ
感覺好像蛋白質都沒有 被分離開or依然卡在well上 一樣...Q皿Q
請問這是發生什麼事? 會是什麼原因? 有什麼改善方法嗎?
謝謝
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我在均質的時候就直接將組織放在1.5cc的eppendorf加入RIPA,然後就直接均質,
4度C 13000轉 10分鐘 離心後取上清液定量,-20度保存
上清液的顏色是有一點那種淡淡的血水那種感覺............
(有點像豬肉解凍後低下來的血水那樣)
(這情形讓我很不安...這是正常狀況嗎?)
喔...對了...我大約是0.2mg左右的tissue配300ul的RIPA下去均質,
定量後蛋白質量接近 1ug/ul (大約0.9X左右)
western時,蛋白質取的量是 40ug/well
之前有試過,將其中一支用不到的sample死馬當活馬醫:
我在電泳前又在sample加入RIPA稀釋,就不會這樣勾勾的,
不過洗片依然"白帥帥" T皿T
我在想應該是RIPA把蛋白質給稀釋過頭了,所以表現量低到偵測不到...
也試過homogenize後再用sonication震一次,
但效果也沒有多好...
是我sonicate震太小嗎? 或是?
找了些資料也有爬過,不過沒看過類似我這樣的狀況...
做實驗遇到這種"前無古人後無來者"...
實在是 好討厭的感覺呀~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~>"<
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◆ From: 118.171.64.227
1F：→ missoul:有positive確認抗體效能嗎? 08/12 03:16
2F：→ glencan:恩 不過慘的是連Actin也沒有出現...@@ 08/12 13:14
3F：推 hchs890843:RIPA掛了?!我有遇過上清稠稠的狀況，pellet也不怎麼 08/12 23:59
4F：→ hchs890843:離的下來...如果這樣建議重配RIPA>"< 08/12 23:59
5F：→ glencan:謝謝 ^^ 我會試試看 (我們家的RIPA的確有點年紀了 @@ ) 08/13 16:27