作者iris416 (Mei-Mei)
看板Biotech
標題[求救] DNA難溶~!
時間Tue Aug 11 21:53:27 2009
這兩天用TRIzol抽取DNA
然後卡在最後一步的回溶步驟>"<
我把DNA pellet dry的很乾以後(大約放在高處5min)
再回溶在NaOH裡面~並且放置在乾浴器55度C環境約略30min~
但是eppendorf底部的管璧上還殘留一些霧霧的東西
好像是pellet黏在管璧上面了~
我擔心放太久DNA會壞掉
就直接拿去nanodrop測OD
我吸了比較上面的液體~出現了兩個peak>"<
然後又吸了eppendorf底部的管璧(有點稠稠像鼻涕一樣)結果DNA的濃度竟然爆走
測到一個peak但是濃度3000ng/ul... 我稍微看了一下 A260/A280 ratio是1.88
這樣應該是有抽到DNA吧~?
但是濃度有點不正常~之前學姊的濃度都100以內= =@@
我懷疑應該是DNA還在管子底部沒有溶掉才會這樣...
學姊是建議我先將DNA放置在4度C冰箱明天在來繼續回溶
但是我今天都放30min了!覺得有點危險~
請問各位經驗豐富的前輩們我要怎麼改善DNA難溶的問題?
到底我哪一步錯了?(查資料上是寫DNA不能dry太乾)
如果真的不能溶,還是不是可以拿來跑PCR?(因為明天可能要跑PCR)
欸~第一次抽DNA好不容易抽出來了..真的不想敗在回溶這一步阿..
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◆ From: 163.25.118.150
1F：推 micocat:RNA? 08/11 21:55
2F：→ iris416:是DNA~因為TRIzol可以抽DNA跟RNA~這次我要的是DNA 08/11 22:01
3F：→ iris416:RNA也一起抽了~但是有溶完全~而且也不是馬上要做 08/11 22:02
4F：推 aunbis:熱過的水(60'C) TE buffer試過了嗎 08/11 22:37
5F：→ iris416:沒有耶~因為照著protocal已經加了NaOH~因為學姊已經做完了 08/11 23:16
6F：→ iris416:沒有什麼問題...改TE BUFFER真的會比較好嗎?? 08/11 23:18
7F：→ iris416:如果真的有必要再加TE 下去~該加多少比較好? 08/11 23:20
8F：推 duckie:我記得DNA跟RNA不能全乾耶 會難溶 08/11 23:59
9F：→ duckie:然後TRIzol上有說8mM NaOH回溶後 以>12000g離心10min 去除 08/12 00:01
10F：→ duckie:不溶物質(如膜etc.) 留上清液 08/12 00:02
11F：推 duckie:如果真的不溶的話 要不要試著把它丟到60度水浴? 08/12 00:05
12F：→ iris416:水浴或加熱可以加多久呢??因為我今天已經放56度30min了 08/12 00:12
13F：→ iris416:加熱太久是不是不好呀? 怕DNA壞掉之類的 08/12 00:13
14F：推 duckie:既然都熱那麼久了 那就把那些東西離掉好了 我是看TRIzol附 08/12 00:15
15F：→ duckie:的protocol寫的來做 08/12 00:17
17F：→ iris416:恩恩~但是那層霧霧的測出來濃度3000多~難道不會是DNA嗎? 08/12 00:40
18F：→ iris416:protocal我有~但是我怕不小心就把DNA去掉~不過還是謝謝!! 08/12 00:42
19F：推 kemp6611:推用60度C的TE BUFFER溶DNA~~效果應該比較好~~ 08/12 01:24
20F：→ kemp6611:若擔心無法全溶~~可以分兩次溶解阿~~到時在濃縮就好了 08/12 01:25
21F：→ kemp6611:我比較擔心的是那個沉澱物搞不好是變性的蛋白or其它雜質 08/12 01:27
22F：推 bluecsky:出現兩個peak不太正常吧 不過要做PCR應該還是可以做.. 08/12 08:35
23F：推 yangkoumi:你的peak是不是有出現在280nm? 有的話應該是蛋白質沒去 08/12 12:34
24F：→ yangkoumi:乾淨導致的 另外測濃度之前可以先vortex5秒 確定有均勻 08/12 12:35
25F：→ yangkoumi:另外 之後如果還是結果不好 下一次抽的時候可在溶pellet 08/12 12:36
26F：→ yangkoumi:時 以65度熱水浴1小時 促進溶解 08/12 12:37
27F：→ iris416:有出現在280~今天重測也是兩個peak在230及280那~A260/280 08/12 14:56
28F：→ iris416:為1.3~1.8左右~不知道怎麼每次測出來都會不太一樣...濃度 08/12 14:57
29F：→ iris416:從70~100多都有..(同一管)雖然這樣但還是先拿去做long-PCR 08/12 14:58
30F：→ iris416:跟Real-time了~不知道做不做得出來~現在只能試試看! 08/12 14:59
31F：→ iris416:根據我家助理說的~他絕得有可能有混雜protein~ 08/12 14:59
32F：→ iris416:謝謝熱心的大大回答~只能等PCR跑完再說了..希望不會白做工 08/12 15:01
33F：推 rurucherry:請問你的sample是什麼?cell還是tissue?有的tissue會有 08/16 16:06
34F：→ rurucherry:這樣的情形發生喔~你也可以是是把sample的量放少點 08/16 16:07
35F：→ rurucherry:我的也之前是這樣阿...囧 08/16 16:08
36F：→ iris416:是cell的~不過問題已經解決了^^溶不掉的是protein跟雜質 08/18 23:52