作者iris416 (Mei-Mei)
看板Biotech
标题[求救] DNA难溶~!
时间Tue Aug 11 21:53:27 2009
这两天用TRIzol抽取DNA
然後卡在最後一步的回溶步骤>"<
我把DNA pellet dry的很乾以後(大约放在高处5min)
再回溶在NaOH里面~并且放置在乾浴器55度C环境约略30min~
但是eppendorf底部的管璧上还残留一些雾雾的东西
好像是pellet黏在管璧上面了~
我担心放太久DNA会坏掉
就直接拿去nanodrop测OD
我吸了比较上面的液体~出现了两个peak>"<
然後又吸了eppendorf底部的管璧(有点稠稠像鼻涕一样)结果DNA的浓度竟然爆走
测到一个peak但是浓度3000ng/ul... 我稍微看了一下 A260/A280 ratio是1.88
这样应该是有抽到DNA吧~?
但是浓度有点不正常~之前学姊的浓度都100以内= =@@
我怀疑应该是DNA还在管子底部没有溶掉才会这样...
学姊是建议我先将DNA放置在4度C冰箱明天在来继续回溶
但是我今天都放30min了!觉得有点危险~
请问各位经验丰富的前辈们我要怎麽改善DNA难溶的问题?
到底我哪一步错了?(查资料上是写DNA不能dry太乾)
如果真的不能溶,还是不是可以拿来跑PCR?(因为明天可能要跑PCR)
欸~第一次抽DNA好不容易抽出来了..真的不想败在回溶这一步阿..
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.118.150
1F：推 micocat:RNA? 08/11 21:55
2F：→ iris416:是DNA~因为TRIzol可以抽DNA跟RNA~这次我要的是DNA 08/11 22:01
3F：→ iris416:RNA也一起抽了~但是有溶完全~而且也不是马上要做 08/11 22:02
4F：推 aunbis:热过的水(60'C) TE buffer试过了吗 08/11 22:37
5F：→ iris416:没有耶~因为照着protocal已经加了NaOH~因为学姊已经做完了 08/11 23:16
6F：→ iris416:没有什麽问题...改TE BUFFER真的会比较好吗?? 08/11 23:18
7F：→ iris416:如果真的有必要再加TE 下去~该加多少比较好? 08/11 23:20
8F：推 duckie:我记得DNA跟RNA不能全乾耶 会难溶 08/11 23:59
9F：→ duckie:然後TRIzol上有说8mM NaOH回溶後 以>12000g离心10min 去除 08/12 00:01
10F：→ duckie:不溶物质(如膜etc.) 留上清液 08/12 00:02
11F：推 duckie:如果真的不溶的话 要不要试着把它丢到60度水浴? 08/12 00:05
12F：→ iris416:水浴或加热可以加多久呢??因为我今天已经放56度30min了 08/12 00:12
13F：→ iris416:加热太久是不是不好呀? 怕DNA坏掉之类的 08/12 00:13
14F：推 duckie:既然都热那麽久了 那就把那些东西离掉好了 我是看TRIzol附 08/12 00:15
15F：→ duckie:的protocol写的来做 08/12 00:17
17F：→ iris416:恩恩~但是那层雾雾的测出来浓度3000多~难道不会是DNA吗? 08/12 00:40
18F：→ iris416:protocal我有~但是我怕不小心就把DNA去掉~不过还是谢谢!! 08/12 00:42
19F：推 kemp6611:推用60度C的TE BUFFER溶DNA~~效果应该比较好~~ 08/12 01:24
20F：→ kemp6611:若担心无法全溶~~可以分两次溶解阿~~到时在浓缩就好了 08/12 01:25
21F：→ kemp6611:我比较担心的是那个沉淀物搞不好是变性的蛋白or其它杂质 08/12 01:27
22F：推 bluecsky:出现两个peak不太正常吧 不过要做PCR应该还是可以做.. 08/12 08:35
23F：推 yangkoumi:你的peak是不是有出现在280nm? 有的话应该是蛋白质没去 08/12 12:34
24F：→ yangkoumi:乾净导致的 另外测浓度之前可以先vortex5秒 确定有均匀 08/12 12:35
25F：→ yangkoumi:另外 之後如果还是结果不好 下一次抽的时候可在溶pellet 08/12 12:36
26F：→ yangkoumi:时 以65度热水浴1小时 促进溶解 08/12 12:37
27F：→ iris416:有出现在280~今天重测也是两个peak在230及280那~A260/280 08/12 14:56
28F：→ iris416:为1.3~1.8左右~不知道怎麽每次测出来都会不太一样...浓度 08/12 14:57
29F：→ iris416:从70~100多都有..(同一管)虽然这样但还是先拿去做long-PCR 08/12 14:58
30F：→ iris416:跟Real-time了~不知道做不做得出来~现在只能试试看! 08/12 14:59
31F：→ iris416:根据我家助理说的~他绝得有可能有混杂protein~ 08/12 14:59
32F：→ iris416:谢谢热心的大大回答~只能等PCR跑完再说了..希望不会白做工 08/12 15:01
33F：推 rurucherry:请问你的sample是什麽?cell还是tissue?有的tissue会有 08/16 16:06
34F：→ rurucherry:这样的情形发生喔~你也可以是是把sample的量放少点 08/16 16:07
35F：→ rurucherry:我的也之前是这样阿...囧 08/16 16:08
36F：→ iris416:是cell的~不过问题已经解决了^^溶不掉的是protein跟杂质 08/18 23:52