作者Basketball (future)
看板Biotech
標題[求救] HIF-1a 的western 條件
時間Thu Aug 6 12:06:12 2009
最近在跑HIF-1a
不知道是不是transfer的問題還怎樣
一下壓得出來同樣sample同樣condition又壓不出來
不知道版上是否也有人在跑HIF-1a的能否給我些意見
我使用是8%下膠 3%上膠
transfer是使用濕式 400mA 70分鐘 (實驗室學姐之前用此條件跑iNOS 130KDa都有跑出來)
gel用comassin blue染後確定有transfer過去
memb.用麗春紅染有淡淡的protein(所以不知道是不是transfer條件不好?)
壓出來有時候有 有時候沒有
ECL 也用過advance的 也壓不出來
sample 每well load 50ug(是細胞的 所以應該算load夠多了)
總之 請有在跑HIF-1a的給我些建議
謝啦.
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 192.192.93.172
1F：推 lail:我沒跑過,不過會不會是抗體的問題?放個positive control看看 08/06 13:05
2F：→ lssunti:hif-1a 在normoxia下本身就會被degrade 你的處理是？ 08/06 14:14
3F：推 ssuny:同意樓上,大部分細胞在正常狀態下培養是偵測不到HIF的 08/06 23:10
4F：→ Basketball:喔 我的條件是在缺氧的情況下 而且我也有做DFO組 08/07 00:47
5F：推 spermwarm:實驗室的學弟也有作HIF-1a 開始收不到HIF-1a protein 08/07 13:21
6F：→ spermwarm:的原因是因為他在lysis時就 degrade光了 所以來收的方法 08/07 13:21
7F：→ spermwarm:改成Lysis buffer加到dish上 後用刮的收完後 馬上離心 08/07 13:23
8F：→ spermwarm:全程4度C 且離心時間縮短成15min 之後馬上煮起來跑膠 08/07 13:24
9F：→ spermwarm:你可以參考看看 08/07 13:24
10F：→ Basketball:恩恩感謝樓上的建議我會試看看的 那可以再請問一下 08/07 16:08
11F：→ Basketball:你學弟 tansfer的條件嗎? 謝啦 08/07 16:09
12F：→ spermwarm:Transfer的條件我們家是semi-dry 50mA/片 for 1.5hr 08/07 16:31
13F：→ spermwarm:我覺得應該不是transfer的問題 是HIF-1a本來就很難壓 08/07 16:33