作者Basketball (future)
看板Biotech
标题[求救] HIF-1a 的western 条件
时间Thu Aug 6 12:06:12 2009
最近在跑HIF-1a
不知道是不是transfer的问题还怎样
一下压得出来同样sample同样condition又压不出来
不知道版上是否也有人在跑HIF-1a的能否给我些意见
我使用是8%下胶 3%上胶
transfer是使用湿式 400mA 70分钟 (实验室学姐之前用此条件跑iNOS 130KDa都有跑出来)
gel用comassin blue染後确定有transfer过去
memb.用丽春红染有淡淡的protein(所以不知道是不是transfer条件不好?)
压出来有时候有 有时候没有
ECL 也用过advance的 也压不出来
sample 每well load 50ug(是细胞的 所以应该算load够多了)
总之 请有在跑HIF-1a的给我些建议
谢啦.
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 192.192.93.172
1F：推 lail:我没跑过,不过会不会是抗体的问题?放个positive control看看 08/06 13:05
2F：→ lssunti:hif-1a 在normoxia下本身就会被degrade 你的处理是？ 08/06 14:14
3F：推 ssuny:同意楼上,大部分细胞在正常状态下培养是侦测不到HIF的 08/06 23:10
4F：→ Basketball:喔 我的条件是在缺氧的情况下 而且我也有做DFO组 08/07 00:47
5F：推 spermwarm:实验室的学弟也有作HIF-1a 开始收不到HIF-1a protein 08/07 13:21
6F：→ spermwarm:的原因是因为他在lysis时就 degrade光了 所以来收的方法 08/07 13:21
7F：→ spermwarm:改成Lysis buffer加到dish上 後用刮的收完後 马上离心 08/07 13:23
8F：→ spermwarm:全程4度C 且离心时间缩短成15min 之後马上煮起来跑胶 08/07 13:24
9F：→ spermwarm:你可以参考看看 08/07 13:24
10F：→ Basketball:恩恩感谢楼上的建议我会试看看的 那可以再请问一下 08/07 16:08
11F：→ Basketball:你学弟 tansfer的条件吗? 谢啦 08/07 16:09
12F：→ spermwarm:Transfer的条件我们家是semi-dry 50mA/片 for 1.5hr 08/07 16:31
13F：→ spermwarm:我觉得应该不是transfer的问题 是HIF-1a本来就很难压 08/07 16:33