我不太清楚你的實驗目的為何,不過從結果來看,可以推論這蛋白質的穩定, 離子鍵扮演重要的角色,因此當D變成E的時候,因都帶負電所以沒什麼影響, 可是當帶正電Arg變成不帶電的Ala,因此無法形成離子鍵,因此會影響蛋白 質的穩定,因而影響摺疊。 在實驗的部份,用低溫的策略是可行的,不過轉速可以調慢,慢慢震盪就好了, 另外表現時菌液的濃度O.D.600=0.8有點高,也許可以試試0.4-0.6。而IPTG 的濃度uM等級就可以了。如果再不行的話可以加3-5% 的ethanol促進 chaperone的表現,也許可以幫助摺疊。表現的部份就試條件,也許運氣好就 讓你試到了。 當然也可拿inclusion bodies來做refolding,這個方法也不見得會成功 。可以將inclsion bodies溶在urea或者guanidium chloride然後將 solution慢慢倒入refolding buffer,使urea的濃度降到1.8-2.3 M。 另外也可將溶在urea的proteins以梯度透析的方式降低urea的濃度, 避免濃度變化過快,而影響proteins folding。另外也有一種方法就 是改變pH值將cofactor加入。方法有很多,不過還是要看蛋白質的特性。 如果還是不行,就試試不同的表現系統,如真菌的yeast。glycosylation 會穩定蛋白質的結構,也許可以幫助蛋白質摺疊。 另外很多膜蛋白不溶於極性的溶液中,因此加入detergent,來幫助solubility。 這個方法可用來養晶。 ※ 引述《BLACKOA (OA)》之銘言： : 大家好,小弟在蛋白誘導上遇到了一個問題 : 我想要誘導的蛋白原本是在D70E有做改變 : 然後我在BL21/pLysS,在pET15b(low copy number)上做誘導 : 簡單的誘導過程如下: : 1. O/N culture in LB with antibiotics and 0.1% glucose : 2. 1:100 diluted in 200ml LB (500ml flask) with 0.01% glucose : shaking culture at 37度C, 200 rpm until OD600 reaches 0.8 : 3. add IPTG to final concentration 1mM and shaking culture at 18度C, 200rpm : 4. 1 hour later, collect bacteria and disrupt them : 5. pellet and the supernatant of the disrupted bacteria were collected : 6. western blot : 基本上是這樣,然後可以看到只有D70E突變的蛋白可以明顯誘導出來,而且是 : soluble form居多(因為可以在disrupted bacteira的supernantant看到誘導的蛋白) : 可是 : 假如同時做R242A的突變時(也就是現在的蛋白同時有D70E跟R242A的突變) : 在同樣的系統與條件下誘導的時候 : 卻發現蛋白主要都是在inclusion body裡面,幾乎都是insoluble form : 覺得很奇怪 : 不曉得有沒有人對於這個有任何想法嗎? : 我自己正在試降低IPTG的濃度(想要試0.5mM, 0.1mM, 0.05mM), : 然後想要把induction的溫度降到16度C : 想要試著降低誘導的速度 : 看能不能改善蛋白的溶解度 : 不過, : 想在這邊跟大家請教看看有沒有別的想法 : 謝謝 --

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