作者BLACKOA (OA)
看板Biotech
標題[求救] 怎麼改善蛋白誘導的solubility?
時間Wed Jul 29 23:41:59 2009
大家好,小弟在蛋白誘導上遇到了一個問題
我想要誘導的蛋白原本是在D70E有做改變
然後我在BL21/pLysS,在pET15b(low copy number)上做誘導
簡單的誘導過程如下:
1. O/N culture in LB with antibiotics and 0.1% glucose
2. 1:100 diluted in 200ml LB (500ml flask) with 0.01% glucose
shaking culture at 37度C, 200 rpm until OD600 reaches 0.8
3. add IPTG to final concentration 1mM and shaking culture at 18度C, 200rpm
4. 1 hour later, collect bacteria and disrupt them
5. pellet and the supernatant of the disrupted bacteria were collected
6. western blot
基本上是這樣,然後可以看到只有D70E突變的蛋白可以明顯誘導出來,而且是
soluble form居多(因為可以在disrupted bacteira的supernantant看到誘導的蛋白)
可是
假如同時做R242A的突變時(也就是現在的蛋白同時有D70E跟R242A的突變)
在同樣的系統與條件下誘導的時候
卻發現蛋白主要都是在inclusion body裡面,幾乎都是insoluble form
覺得很奇怪
不曉得有沒有人對於這個有任何想法嗎?
我自己正在試降低IPTG的濃度(想要試0.5mM, 0.1mM, 0.05mM),
然後想要把induction的溫度降到16度C
想要試著降低誘導的速度
看能不能改善蛋白的溶解度
不過,
想在這邊跟大家請教看看有沒有別的想法
謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 62.252.24.130
※ 編輯: BLACKOA 來自: 62.252.24.130 (07/29 23:47)
1F：推 simonmiho:可能把R變A對overall structure folding改變很大吧.. 07/30 00:00
2F：→ simonmiho:才會便成inclusion body..如果mutant成KorH 也許還能 07/30 00:03
3F：→ simonmiho:是soluble... 07/30 00:03
4F：→ turtle24:看起來像folding出錯了 07/30 00:03
5F：推 claudiachen9:或許可以試試換宿主.... 07/30 16:13