作者BLACKOA (OA)
看板Biotech
标题[求救] 怎麽改善蛋白诱导的solubility?
时间Wed Jul 29 23:41:59 2009
大家好,小弟在蛋白诱导上遇到了一个问题
我想要诱导的蛋白原本是在D70E有做改变
然後我在BL21/pLysS,在pET15b(low copy number)上做诱导
简单的诱导过程如下:
1. O/N culture in LB with antibiotics and 0.1% glucose
2. 1:100 diluted in 200ml LB (500ml flask) with 0.01% glucose
shaking culture at 37度C, 200 rpm until OD600 reaches 0.8
3. add IPTG to final concentration 1mM and shaking culture at 18度C, 200rpm
4. 1 hour later, collect bacteria and disrupt them
5. pellet and the supernatant of the disrupted bacteria were collected
6. western blot
基本上是这样,然後可以看到只有D70E突变的蛋白可以明显诱导出来,而且是
soluble form居多(因为可以在disrupted bacteira的supernantant看到诱导的蛋白)
可是
假如同时做R242A的突变时(也就是现在的蛋白同时有D70E跟R242A的突变)
在同样的系统与条件下诱导的时候
却发现蛋白主要都是在inclusion body里面,几乎都是insoluble form
觉得很奇怪
不晓得有没有人对於这个有任何想法吗?
我自己正在试降低IPTG的浓度(想要试0.5mM, 0.1mM, 0.05mM),
然後想要把induction的温度降到16度C
想要试着降低诱导的速度
看能不能改善蛋白的溶解度
不过,
想在这边跟大家请教看看有没有别的想法
谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 62.252.24.130
※ 编辑: BLACKOA 来自: 62.252.24.130 (07/29 23:47)
1F：推 simonmiho:可能把R变A对overall structure folding改变很大吧.. 07/30 00:00
2F：→ simonmiho:才会便成inclusion body..如果mutant成KorH 也许还能 07/30 00:03
3F：→ simonmiho:是soluble... 07/30 00:03
4F：→ turtle24:看起来像folding出错了 07/30 00:03
5F：推 claudiachen9:或许可以试试换宿主.... 07/30 16:13