※ 引述《peggy814 ( )》之銘言： : 最近準備要作miRNA的實驗 : 老闆是打算自己clone miRNA的 construct : 看了paper之後 : 他們是clone pre-miRNA insert由PCR得到 : paper上使用的PCR primer是根據pre-miRNA的sequence : 設計overlapping的primer : forward和reverse的primer分別大概是60~80 mer : 我找了幾個paper裡面所clone的miRNA : 對了miRBase裡面的sequence之後 : 只能看出forward和reverse primer大概有overlap十幾二十個mer : (不同的miRNA overlap程度不同) : 想請問如果我要設計primer的話 : 是只要forward和reverse primer有overlap到就可以了嗎? : 還是有其他的需要注意? : 謝謝^^ 其實 我們實驗室都不是這樣做的 只要合幾條primer就可以了 不需要用到PCR 把pre-miRNA兩端再加上vector的cutting site ligation時一起丟進去就可以了 舉例來說: vector兩邊的cutting site 是 BamH I 和 Hind III pre-miRNA sequence是AAATTTCCGCGC 分別合兩條primer G\GATC C AAATTTCCGCGC A\AGCT T C CTAG\G TTTAAAGGCGCG T TCGA\A primer 5'都要磷酸化才能黏的上 (可以請廠商加或買kinase自己加) 如果pre-miRNA太長 也可以分成好幾段 像這樣: G\GATC C AAATTTCC GCGCAATTCCGGGTTA A\AGCT T C CTAG\G TTTAAAGGCGCG TTAAGGCCCAAT T TCGA\A 請廠商加 一條要加大概1千多 時間也要比較久 所以我們都是買kinase自己做 如果只有一兩個construct也可以直接請廠商加 當然 siRNA也可以這樣做 希望對您有幫助 --

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