※ 引述《peggy814 ( )》之铭言： : 最近准备要作miRNA的实验 : 老板是打算自己clone miRNA的 construct : 看了paper之後 : 他们是clone pre-miRNA insert由PCR得到 : paper上使用的PCR primer是根据pre-miRNA的sequence : 设计overlapping的primer : forward和reverse的primer分别大概是60~80 mer : 我找了几个paper里面所clone的miRNA : 对了miRBase里面的sequence之後 : 只能看出forward和reverse primer大概有overlap十几二十个mer : (不同的miRNA overlap程度不同) : 想请问如果我要设计primer的话 : 是只要forward和reverse primer有overlap到就可以了吗? : 还是有其他的需要注意? : 谢谢^^ 其实 我们实验室都不是这样做的 只要合几条primer就可以了 不需要用到PCR 把pre-miRNA两端再加上vector的cutting site ligation时一起丢进去就可以了 举例来说: vector两边的cutting site 是 BamH I 和 Hind III pre-miRNA sequence是AAATTTCCGCGC 分别合两条primer G\GATC C AAATTTCCGCGC A\AGCT T C CTAG\G TTTAAAGGCGCG T TCGA\A primer 5'都要磷酸化才能黏的上 (可以请厂商加或买kinase自己加) 如果pre-miRNA太长 也可以分成好几段 像这样: G\GATC C AAATTTCC GCGCAATTCCGGGTTA A\AGCT T C CTAG\G TTTAAAGGCGCG TTAAGGCCCAAT T TCGA\A 请厂商加 一条要加大概1千多 时间也要比较久 所以我们都是买kinase自己做 如果只有一两个construct也可以直接请厂商加 当然 siRNA也可以这样做 希望对您有帮助 --

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