作者killua1214 (奇犽)
看板Biotech
標題[求救] 冷凍切片破洞和H&E stain的ㄧ些問題
時間Wed Jul 22 23:32:21 2009
其實還蠻多問題的，做了兩個多月，這有ㄧ些問題ㄧ直不時的出現...
在問問題前我先把我大致的實驗流程解釋ㄧ下
首先我要看的是小鼠的腫瘤和非腫瘤在小鼠的肝臟中表現的差異
我們的小鼠是帶有EGFP這個transgene的小鼠會表現在liver當中
流程如下
sacrifice 小鼠取出liver
↓
4% PFA fix
↓
PBS wash
↓
sucrose脫水(6%,2hr→12%,2hr→18%,2hr→24%,2hr→30%,overnight)
↓
OCT包埋
↓
-20度冷凍切片(6um) by 切片機
↓
(儲藏在-30度)
↓
用90% glycerol+10% PBS, mount cover slide,用螢光顯微鏡看tissue螢光表現
↓
用PBS洗掉cover slide，再H&E stain
↓
Hematoxylin
↓
1% HCl in 70% ETOH (acid alcohol), dip several times
↓
ammonia, dip several times
↓
Eosin
↓
脫水(70% ETOH→90% ETOH→100% ETOH→Xylene→封片)
結果發生了幾個問題
問題1:我的H&E stain後，tissue經常會有破洞，破成網狀..(如果有需要我可以附圖)
問題2:H&E stain後會有非細胞核的區域出現Hematoxylin染上的小點點，有時候還蠻多的
問題3:H&E stain的顏色我ㄧ直抓不到一個固定的condition來固定顏色表現，常常
會太紅或太紫，有時後染顏色的就不錯很能區分核和質
另外，有的時候Hematoxylin染色會有帶狀的情形發生，顏色分不不均勻，
我染色都適用染缸，所以理論上上色應該要均勻，除非tissue厚薄不ㄧ(有可能嗎)?
問題4:在染色前我會用90% glycerol+10% PBS, mount cover slide然後看螢光表現，
有時後細胞的morphology會變得怪怪的，細胞邊緣不是那麼明顯
問題5:另外我想問ㄧ下，ㄧ般OCT放冰箱可以放多久?切好的tissue已mount在slide
上的玻片可以放多久?放幾度?
另外要如何避免開關冰箱對凍切的tissue產生冷凍、解凍的傷害?
不知道有沒有人有類似的問題，最近真的碰到瓶頸，無助>"<
有人可以幫我解答嗎>"<
先謝謝各位了m(_"_)m
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 118.168.135.149
1F：→ vandia:我是覺得可能是沒有固定好耶，請問你fix的condition跟時間? 07/22 23:36
2F：→ schmitt:1.切片機的刀片是否磨損要更換 07/23 01:31
3F：→ schmitt:2.fit時避免氣泡進入 07/23 01:32
4F：→ schmitt:3.洗掉cover slide時 組織是否會被傷到 07/23 01:33
5F：→ killua1214:我fix是用4%PFA,30min,4度 07/23 09:26
6F：→ killua1214:切片刀我大概沏兩三個OCT後就會換新 07/23 09:27
7F：→ killua1214:schmitt大說的沒錯，洗掉cover slide時組織確實很容易 07/23 09:29
8F：→ killua1214:弄傷，所以後來我染色和看螢光分不同片，不過偶爾還是 07/23 09:29
9F：→ killua1214:會出現以上的情形>"< 07/23 09:29
10F：→ starssea2009:為什麼你需要用到HCL?? 07/23 11:58
11F：→ killua1214:網路上找到的protocol,acid alcohol可以退染hematoxyli 07/23 12:43
12F：→ killua1214:我覺得退染過的,eosin比較容易上色.. 07/23 12:44
13F：→ starssea2009:通常冷凍切片用OCT包埋者無須固定和脫水,Hematoxlin 07/23 13:16
14F：→ starssea2009:用水退染即可(抓好時間就好)因HCL是強酸,應該不適合 07/23 13:18
15F：→ starssea2009:用水退染就好(抓好時間就好),HCL是強酸,應該不適合 07/23 13:19
16F：→ starssea2009:相同的eosin也是抓好時間就OK,你似乎多了太多的步驟~ 07/23 13:21
17F：→ starssea2009:以上你可以操考看看~ 07/23 13:23
18F：→ starssea2009:sorry! key錯字~ 以上你可以參考看看~ ^^ 07/23 13:24
19F：→ vandia:目前我看過以及使用過的方式，固定時間都遠超過30分鐘喔 07/23 20:42
20F：→ vandia:如果你在染HE之前就看不到細胞的外型 可能要考慮換別的固定 07/23 20:43
21F：→ vandia:方式 或者將你的組織切的更小塊 改善固定的效率 07/23 20:44
22F：→ vandia:當然 破碎的細胞也常常是因為切片過程沒處理好所導致 07/23 20:45
23F：→ vandia:忘了說 30min內的固定時間通常是出現在固定cultured cell 07/23 21:03
24F：→ schmitt:starssea2009說的沒錯 07/24 00:33
25F：→ schmitt:熊熊想到請注意退染時間會引想到太紅或太紫 07/24 00:36
26F：→ killua1214:關於固定的時間，其實我也不知道我要用多久.. 07/24 12:50
27F：→ killua1214:我是用後固定，liver 切片後在泡在4%PFA當中，因為我的 07/24 12:51
28F：→ killua1214:tissue還蠻小的(平常OCT block可以放兩到三片)，所以說 07/24 12:52
29F：→ killua1214:我怕放太久會有別的effect出現，因為fix時間和tissue大 07/24 12:54
30F：→ killua1214:小有關，所以我是不是要test一下fixation的時間? 07/24 12:55