作者killua1214 (奇犽)
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标题[求救] 冷冻切片破洞和H&E stain的ㄧ些问题
时间Wed Jul 22 23:32:21 2009
其实还蛮多问题的，做了两个多月，这有ㄧ些问题ㄧ直不时的出现...
在问问题前我先把我大致的实验流程解释ㄧ下
首先我要看的是小鼠的肿瘤和非肿瘤在小鼠的肝脏中表现的差异
我们的小鼠是带有EGFP这个transgene的小鼠会表现在liver当中
流程如下
sacrifice 小鼠取出liver
↓
4% PFA fix
↓
PBS wash
↓
sucrose脱水(6%,2hr→12%,2hr→18%,2hr→24%,2hr→30%,overnight)
↓
OCT包埋
↓
-20度冷冻切片(6um) by 切片机
↓
(储藏在-30度)
↓
用90% glycerol+10% PBS, mount cover slide,用萤光显微镜看tissue萤光表现
↓
用PBS洗掉cover slide，再H&E stain
↓
Hematoxylin
↓
1% HCl in 70% ETOH (acid alcohol), dip several times
↓
ammonia, dip several times
↓
Eosin
↓
脱水(70% ETOH→90% ETOH→100% ETOH→Xylene→封片)
结果发生了几个问题
问题1:我的H&E stain後，tissue经常会有破洞，破成网状..(如果有需要我可以附图)
问题2:H&E stain後会有非细胞核的区域出现Hematoxylin染上的小点点，有时候还蛮多的
问题3:H&E stain的颜色我ㄧ直抓不到一个固定的condition来固定颜色表现，常常
会太红或太紫，有时後染颜色的就不错很能区分核和质
另外，有的时候Hematoxylin染色会有带状的情形发生，颜色分不不均匀，
我染色都适用染缸，所以理论上上色应该要均匀，除非tissue厚薄不ㄧ(有可能吗)?
问题4:在染色前我会用90% glycerol+10% PBS, mount cover slide然後看萤光表现，
有时後细胞的morphology会变得怪怪的，细胞边缘不是那麽明显
问题5:另外我想问ㄧ下，ㄧ般OCT放冰箱可以放多久?切好的tissue已mount在slide
上的玻片可以放多久?放几度?
另外要如何避免开关冰箱对冻切的tissue产生冷冻、解冻的伤害?
不知道有没有人有类似的问题，最近真的碰到瓶颈，无助>"<
有人可以帮我解答吗>"<
先谢谢各位了m(_"_)m
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 118.168.135.149
1F：→ vandia:我是觉得可能是没有固定好耶，请问你fix的condition跟时间? 07/22 23:36
2F：→ schmitt:1.切片机的刀片是否磨损要更换 07/23 01:31
3F：→ schmitt:2.fit时避免气泡进入 07/23 01:32
4F：→ schmitt:3.洗掉cover slide时 组织是否会被伤到 07/23 01:33
5F：→ killua1214:我fix是用4%PFA,30min,4度 07/23 09:26
6F：→ killua1214:切片刀我大概沏两三个OCT後就会换新 07/23 09:27
7F：→ killua1214:schmitt大说的没错，洗掉cover slide时组织确实很容易 07/23 09:29
8F：→ killua1214:弄伤，所以後来我染色和看萤光分不同片，不过偶尔还是 07/23 09:29
9F：→ killua1214:会出现以上的情形>"< 07/23 09:29
10F：→ starssea2009:为什麽你需要用到HCL?? 07/23 11:58
11F：→ killua1214:网路上找到的protocol,acid alcohol可以退染hematoxyli 07/23 12:43
12F：→ killua1214:我觉得退染过的,eosin比较容易上色.. 07/23 12:44
13F：→ starssea2009:通常冷冻切片用OCT包埋者无须固定和脱水,Hematoxlin 07/23 13:16
14F：→ starssea2009:用水退染即可(抓好时间就好)因HCL是强酸,应该不适合 07/23 13:18
15F：→ starssea2009:用水退染就好(抓好时间就好),HCL是强酸,应该不适合 07/23 13:19
16F：→ starssea2009:相同的eosin也是抓好时间就OK,你似乎多了太多的步骤~ 07/23 13:21
17F：→ starssea2009:以上你可以操考看看~ 07/23 13:23
18F：→ starssea2009:sorry! key错字~ 以上你可以参考看看~ ^^ 07/23 13:24
19F：→ vandia:目前我看过以及使用过的方式，固定时间都远超过30分钟喔 07/23 20:42
20F：→ vandia:如果你在染HE之前就看不到细胞的外型 可能要考虑换别的固定 07/23 20:43
21F：→ vandia:方式 或者将你的组织切的更小块 改善固定的效率 07/23 20:44
22F：→ vandia:当然 破碎的细胞也常常是因为切片过程没处理好所导致 07/23 20:45
23F：→ vandia:忘了说 30min内的固定时间通常是出现在固定cultured cell 07/23 21:03
24F：→ schmitt:starssea2009说的没错 07/24 00:33
25F：→ schmitt:熊熊想到请注意退染时间会引想到太红或太紫 07/24 00:36
26F：→ killua1214:关於固定的时间，其实我也不知道我要用多久.. 07/24 12:50
27F：→ killua1214:我是用後固定，liver 切片後在泡在4%PFA当中，因为我的 07/24 12:51
28F：→ killua1214:tissue还蛮小的(平常OCT block可以放两到三片)，所以说 07/24 12:52
29F：→ killua1214:我怕放太久会有别的effect出现，因为fix时间和tissue大 07/24 12:54
30F：→ killua1214:小有关，所以我是不是要test一下fixation的时间? 07/24 12:55