※ 引述《pytforyou ()》之銘言： : 大家好 : 我最近做的 Western Blotting : Band 都會被擠壓到 : 而且大都在中間區域的位置 : 不論是大分子量或是小分子量 : 我們實驗室從做膠到 transfer 都是用 Bio-Rad 的系統 : 圖片：http://www.wretch.cc/album/album.php?id=popopaul34&book=5 : 這張圖我秀的算是大分子量的位置 : 大約是在 55kDa 的位置 : 同一張 Blot 大約 25kDa 的位置 : 也有相同的情形發生 : 但是更為嚴重一些 : (24kDa 那邊從 lane 2 到 lane 7 : 都是一樣的狀況) : 我想問的問題是 : 在 lane 4 和 lane 5 的位置 : 發生了什麼事情？ : 我跟實驗室的人討論過 : 有人覺得是大泡泡的影響 : 有人覺得是被擠壓到 : 我個人覺得不是泡泡 : 因為我在做 transfer 的時候 : 都很仔細的看 : 而且我也有請別人幫我確定有沒有泡泡 : 所以我覺得應該不是泡泡的影響 : 不過擠壓到的話 : 我也覺得怪怪的 : 因為我都挑很鬆的那種 transfer casette : 我一定不會硬擠進去 : 另外 : 我問過一個 sales : 她說有可能是膠沒做好 : 她說有可能是因為膠凝的太快 : 而且膠做的不均勻 : 於是我按照板上其他大大的做法 : APS 和 TEMED 的比例為 10:1 : 全部配好之後 : 我用 droper 加到玻璃裡面 : 大約要等 30 分鐘才會凝固 : 以上是 Resolving gel (下膠)的部份 : (我覺得膠做的還滿漂亮的 : 因為下膠和上膠中間的那條線很直 : 不過純屬感覺) : 我們實驗室其他人做 : 大都不會遇到這樣的問題 : 不過我個人遇到這樣的問題機率很高 : 基本上每次做兩片就至少一片會有這樣的狀況 : 昨天做四片有三片都這樣 : 而這樣的問題困擾我許久了 : 因此想問問看大家的意見 : 看看是否能夠改善 : 麻煩大家幫我想想了 : 如果有任何需要的資訊 : 只要在不損害實驗室權利的狀況下 : 我將不吝提供 : 感謝各位了 : 以方便板友幫您追蹤問題 -------------------------------上次問題的分隔線----------------------------- 首先要先感謝一下板上的強者們 因為我的問題解決了 我後來在做 transfer 的時候 在 transfer tank 中加了一個小小的 stir bar 接著，一邊快速旋轉著 stir bar，一邊 transfer 然後所有的問題都解決了 現在每一條 band 都美美的 真的是很感謝大家給我的意見 可是我又有疑問了 為什麼大家都用一樣的方法做實驗 可是卻只有我會有 buffer 溫度(濃度)不均勻的問題呢？ 是我做實驗的習慣問題？ 還是我的手氣比較不好？ 想請大家再給我一些指教！ 感恩～感恩～ --

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