※ 引述《yashi (我要天天快樂快樂)》之銘言： : ※ 引述《yashi (我要天天快樂快樂)》之銘言： : : 我是把real-time PCR做完的產物拿來跑電泳 : : 取15μL的sample加上3μl的dye : : 這次跑出來的sample是β-actin 大小大概是60bp : : PCR跑了40個cycle : : 膠片是1%的agrose gel : : buffer都是1× TBE buffer : : 我之前也是照著這個條件跑 : : 都有跑出結果來 : : 不過最近幾次發現sample都卡在上面下不來… : : 但是marker卻分得滿漂亮的 : : 現在根本不知道問題出在哪裡 : : 覺得很苦惱… : : 希望板上有高手可以幫我解決 : : 感激不盡！！！ : : http://www.wretch.cc/album/show.php?i=yashihuang&b=17&f=1299448889&p=3 昨天看到已經很晚了 所以到現在才回 : 先謝謝很多人願意幫我一起釐清問題 : 其實我個人比較傾向是buffer或是sample的問題哎 同s大表示 如果是這些問題 你的marker不會那麼清楚 : 因為我這個實驗重覆滿多次了 : 條件都是一樣的 1%的膠100V跑40min : 不過之前都沒有這方面的問題 : 而且這次的sample是real-time完的產物 : 而我同時也有跑melting curve : melting是一個很漂亮的peak 這我沒有做很多 不確定real-time偵測到的螢光 比實際的"specific" PCR product是不是絕對正確 也不知道是不是這原因 你們老師才要求你要跑GE 但是gel圖看起來 不知道是背景 還是non-specific 的smear : 我p完的產物放在-20℃冰箱三天我就跑了 : PCR的program也不太可能有人動到… : 因為我們實驗室就只有我瘋狂的在跑real-time PCR : agrose我也都用一樣的 : 附帶一題 : 我的這個照片是用 切膠片用的光箱+數位相機+濾鏡照出來的 : 所以可能照片跟照膠器照出來的 品質會差很多0rz... : 還有我不太了解 所謂的well裡面卡住的是template DNA是什麼意思…？？ : 是代表我的template DNA加太多 所以反應不完全嗎？ 我會說template DNA卡在那邊 因為看你的marker應該是100bp-3k的吧 所以上面殘留的大小 應該是template DNA才對 然後看染色的結果 相對來說 背景那麼強 只有60bp的 band一定會看不到 另外 你的gel只有1% 以往我們要分50-500bp的band都用到3%的gel 或是 5%的 poly-acrylamide gel 1%跑 60bp 跑到下面都糊掉了(你可以看marker的100bp) 片段又很小很難染色 所以什麼都看不到 : 如果是這樣的話可以從real-time PCR的curve或是melting curve看出來嗎？ : (我覺得如果template DNA很多的話 melting curve應該會很醜吧？？？) : 最後 謝謝大家努力幫我解決！！ --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 203.64.80.49